PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.
它包括三個(gè)基本步驟：
(1) 變性(Denature)：目的雙鏈DNA、片段在94℃下解鏈；
(2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對；
(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的適溫度下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。
PCR反應(yīng)中的主要成份：
1、引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：
(1) 引物長度約為16-30bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費(fèi)，且難以合成。
(2) 引物中G+C含量通常為40%-60%，可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。
(3) 四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。
(4) 引物3'端好與目的序列閱讀框架中密碼子或第二位核苷酸對應(yīng)， 以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。
(5) 在引物內(nèi)， 尤其在3'端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)。
(6) 兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ)， 以防出現(xiàn)引物二聚體， 減少產(chǎn)量。兩引物間好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。
(7) 引物5'端對擴(kuò)增特異性影響不大， 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、等。通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。
(8) 引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)， 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響產(chǎn)量。
(9) 簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子， 例如選用只有一種密碼子的Met， 3'端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。
一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體， 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì)， 可計(jì)算引物濃度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物濃度可按下式計(jì)算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩爾濃度，A、C、G、T：引物中4種不同堿基個(gè)數(shù)。
