為什么你的elisa檢測結(jié)果不理想？
點擊次數(shù)：994 更新時間：2019-07-27
為什么你的elisa檢測結(jié)果不理想？
elisa作為經(jīng)典的免疫檢測方法，看起來很平常，然而真正做好它并不容易。有哪些方法可以借鑒呢？我們總結(jié)了幾點：
1. 確定您的樣本類型和試劑盒可以兼容
常見樣本類型有血清，血漿，細胞培養(yǎng)上清，如果是廠家實驗驗證過的，可根據(jù)產(chǎn)品說明購買使用。【注意：血漿制備用到的抗凝劑有 EDTA、檸檬酸鹽、肝素等多種，相應(yīng)的血漿性質(zhì)存在差異，需單獨確認兼容性】。
2. 試劑盒檢測范圍需要匹配樣本中標志物濃度
elisa試劑盒的定量檢測范圍需參考標準曲線，在標準曲線低和高濃度區(qū)間內(nèi)屬于線性范圍，其中的值是可信和可定量的。濃度高于線性范圍的樣品要稀釋到線性范圍內(nèi)來測量，而濃度低于線性范圍的樣品，其測量值不能用于計算濃度，只能用做參考。有一種常見的相關(guān)情況是：健康人樣本中很多標志物的濃度偏低，測量值低于標準曲線低值。
3. 樣本收集有講究
以血清為例，樣本收集可參考試劑盒說明書，但需注意以下要點。樣本盡量用無菌管收集，避免細菌的酶類和代謝產(chǎn)品對結(jié)果的影響。采集過程要避免溶血，因為紅細胞溶解釋放的活性物質(zhì)可能會影響檢測。保存過程中如有沉淀，應(yīng)離心后取上清液。樣本若不立即測定，建議按照每次使用量分裝保存在 -20℃，每次檢測使用一管，即避免交叉污染和反復凍融，有能保證檢測結(jié)果的平行可比性。
4. 實驗前要準備好相應(yīng)試劑
提前將所有試劑平衡到室溫環(huán)境，這個過程大致需半小時左右。洗液是濃縮液，如有結(jié)晶析出，需*溶解后再進行稀釋。A、B 兩管顯色底物在使用前15分鐘按 1:1 配成混合液。為保證蛋白標準品溶液配制質(zhì)量，蛋白標準品為凍干粉，重溶前需將管子離心，加入說明書的緩沖液，慢速在搖床上搖勻或顛倒混勻，至少 15 分鐘，不建議用槍頭吹打。溶解后如需保存，按每次使用量分裝后根據(jù)說明書要求的溫度保存。梯度稀釋蛋白標準品時，建議用聚丙烯管（對蛋白吸附力很低），每步都要充分混勻且更換新槍頭，確保梯度準確性。
5. 儀器設(shè)備的準備也*
相關(guān)設(shè)備包括移液器、洗板機/搖床和酶標儀。移液器的準確性對于ELISA實驗結(jié)果的可靠性十分關(guān)鍵，需要確保定期校準維護。搖床的使用是為了讓反應(yīng)體系快速達到平衡，獲得穩(wěn)定、可重復的結(jié)果。不用搖床對實驗通常的影響是，OD 值低，CV 大。酶標儀等設(shè)備使用前提前 15 分鐘開機預熱。
6. 剩余的試劑盒材料要妥善保存
標準品分裝后按說明書要求的溫度保存，這樣可以避免污染，對要求冷凍保存的標準品還可以避免反復凍融；酶標板放回錫箔紙袋，加入干燥劑，封緊封口，4℃保存。忌未將酶標板*平衡至室溫，就放回錫箔紙袋，因為此時由于溫度差，酶標板上會有水汽，不利于穩(wěn)定保存。
7. 預實驗：通常預實驗包括全部標準曲線和小量樣本。
預實驗有兩個主要目的，一來是熟悉實驗流程，發(fā)現(xiàn)可能忽略的問題；二來是測試樣本和試劑盒是否匹配，一旦出現(xiàn)不匹配的情況，不至于浪費過多樣本。另外是對樣品中目的分析物的豐度作一下大致了解，以確定合適稀釋度。
8. 加樣要快速準確，避免氣泡
加樣時間宜控制在 15 分鐘內(nèi)。加樣前要將樣本混勻，特別是凍存后融化的樣本（自然融化的血清等樣本會有分層現(xiàn)象），應(yīng)上下顛倒充分混勻，注意動作輕緩，避免產(chǎn)生氣泡。如凍存融化后的樣本有沉淀，可以再次離心。整個加樣過程都要注意避免產(chǎn)生氣泡。氣泡會影響蛋白的相互結(jié)合，而影響反應(yīng)進行。
9. 孵育時要保證溫度均勻，防止揮發(fā)變干
孵育時壓緊封口膜。多塊板一起實驗時，要平放各板，不要疊放，以免因溫度不均造成漂移或邊緣效應(yīng)。
10. 手動洗板的操作指南
加洗液要快速，沒有多道移液器可以使用洗瓶。洗液應(yīng)新鮮配制，以免被其他試劑污染，或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板，選用無粉塵和碎屑的吸水紙。需要用力拍板，使孔內(nèi)沒有可見液體掛壁；但也不能太重，不能讓樣品干太久。酶標板拍干后立即做后續(xù)的加液。
11. 顯色反應(yīng)的關(guān)鍵點
elisa試劑盒實驗是個酶促底物顯色反應(yīng)，隨時間增加，顯色變深，所以選擇佳時間終止反應(yīng)是得到準確的標準曲線和樣本濃度的重要因素。終止過程要*。使用的 TMB 底物時*終止點是黃色，不會有任何程度的藍色或綠色，終止過程中必要時可以震蕩 96 孔板，或用槍頭抽吸混勻（終止液含強酸，避免腐蝕）。
