菌落PCR（Colony PCR）方法
點擊次數：1029 更新時間：2020-07-28
菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，省時少力。建議使用載體上的通用引物。通常利用此方法進行重組體的篩選或者DNA測序分析。后的PCR產物大小是載體通用引物之間的插入片斷大小。
具體方法：
1、PCR混合物的制備
Taq buffer（10×） 20 ul
dNTP（2.5 mM） 5 ul
Primer Forward（50 mM） 10 ul
Primer Reverse（50 mM） 10 ul
ddH 2O 147 ul
Taq（2U/ul） 8 ul
total 200 ul
將上述溶液混勻，10 ul每管分裝于200 ul PCR管中。
2、常溫下隨機挑選轉化板上的轉化子，用滅菌的牙簽或槍頭挑取少量菌體，在LB瓊脂糖平板上輕點，做一拷貝；然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應的裝有PCR混合物的PCR管中洗滌數下（管子做好記號，如平板上點的是1＃，則管子上也標1＃，以便篩選到克隆后的擴到培養），蓋緊管子。
3、將混有菌體的PCR混合物置于 PCR儀 中，按常規條件擴增。電泳檢測是否得到目的片斷。如有則為陽性克隆。
4、將已經接種有菌落的平板置37℃培養箱培養過夜，使菌落擴增；次日挑選陽性克隆做進一步篩選或培養。步驟2也可以不點板，直接接種搖菌，如果早上做PCR的話，下午就可以提質粒，得到重組載體。
注意事項：設計引物很關鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如單酶切或平末端連接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯誤概率很低。PCR條件的選擇接近-佳，同時挑取的菌體不宜太多，否則會有非特異性擴增。
