細(xì)胞培養(yǎng)這個(gè)生物學(xué)研究蕞基礎(chǔ)的技術(shù)之一，已經(jīng)滲透進(jìn)了科研工作的方方面面。本文將與大家分享細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，涵蓋了昆蟲(chóng)細(xì)胞蛋白表達(dá)常用到的sf9細(xì)胞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)的CHO細(xì)胞與HEK293細(xì)胞，主要介紹了細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存的具體操作方法。
細(xì)胞復(fù)蘇：
1、細(xì)胞培養(yǎng)條件
2、復(fù)蘇流程：
（1）確認(rèn)水浴鍋的水清潔可用，方可提前打開(kāi)37度預(yù)熱。
（2）確認(rèn)好復(fù)蘇細(xì)胞的液氮罐中具體位置，并做好復(fù)蘇登記。
（3）提前做好復(fù)蘇準(zhǔn)備，預(yù)熱培養(yǎng)基。
（4）懸浮和貼壁細(xì)胞復(fù)蘇參數(shù)：
（5）將細(xì)胞快速放入37度水浴鍋中迅速溶解，1.8 ml時(shí)間大概1分30秒，1 ml大概1 min左右，需計(jì)時(shí)，期間不要老是拿起來(lái)觀察，需要快速?gòu)?fù)溶，避免細(xì)胞受到損傷。
（6） 貼壁細(xì)胞需離心， 1000 rpm，5 min；懸浮細(xì)胞直接加入預(yù)熱的培養(yǎng)基中然后放入培養(yǎng)箱中
（7）貼壁細(xì)胞離心后去除上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后加入到T25方瓶，蕞后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（8）取小樣計(jì)數(shù)觀察，細(xì)胞活力在70%以上算正常。低于70%活力可能細(xì)胞狀態(tài)不太好，需要培養(yǎng)和恢復(fù)。
細(xì)胞傳代培養(yǎng)
1． 懸浮細(xì)胞傳代流程：
（1） 先將裝有細(xì)胞的搖瓶從培養(yǎng)箱拿出，用酒精噴灑瓶身后將搖瓶拿進(jìn)超凈臺(tái)；
（2） 打開(kāi)搖瓶瓶蓋，用200 ul移液器取100~200 ul細(xì)胞放入1.5 mlEP管中，瓶蓋過(guò)火，擰緊，將培養(yǎng)瓶放回?fù)u床；
（3）將200 ul細(xì)胞混勻，取10 ul細(xì)胞加入10 ul臺(tái)盼藍(lán)，顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞數(shù)決定下游實(shí)驗(yàn)；
（4）細(xì)胞需計(jì)數(shù)兩次求平均值；
（5）懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)參數(shù)
（6）根據(jù)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線在合適的時(shí)間和密度給細(xì)胞接種傳代；
以sf9細(xì)胞為例：
細(xì)胞接種密度0.4 x10^6個(gè)/ml,24 h密度1x10^6個(gè)/ml,48 h密度2.4x10^6個(gè)/ml,72 h密度6x10^6個(gè)/ml，此時(shí)需要傳代細(xì)胞；要求留樣100 ml0.4 x10^6個(gè)/ml具體操作如下：
計(jì)算：需要母細(xì)胞體積=100*0.4/6=6.6ml
需要培養(yǎng)基體積=100-6.6=93.4ml
將上面體積的細(xì)胞和培養(yǎng)基加入到搖瓶中，放回27度培養(yǎng)箱培養(yǎng)即可
2. 貼壁細(xì)胞傳代流程：
（1） 顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)和密度，80%匯合率以上需要傳代；
（2） T25方瓶中加入0.5 ml~1 ml 0.25%胰酶溶液（需37度預(yù)熱），使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。放入37度培養(yǎng)箱進(jìn)行消化；
（3） 不同細(xì)胞消化時(shí)間不一樣，初次培養(yǎng)貼壁細(xì)胞消化時(shí)間可以定在1min,顯微鏡下觀察消化結(jié)果，消化不*可以再適度加長(zhǎng)消化時(shí)間；
（4）對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞消化可以定個(gè)準(zhǔn)確的時(shí)間，消化結(jié)束后將培養(yǎng)皿放入顯微鏡下觀察細(xì)胞，隨著時(shí)間變長(zhǎng)，原先貼壁細(xì)胞逐漸變圓，慢慢脫落，在還未飄起時(shí)棄掉胰酶，加入含有10%FBS的新鮮培養(yǎng)基終止消化；
（5） 用1 ml移液器輕輕吹打細(xì)胞，將細(xì)胞全部吹下后，可進(jìn)行傳代，一般是1：3傳代；
（6） 貼壁不牢的細(xì)胞可以用0.1%的凝膠包被4℃ 30min,用PBS清洗5次。
細(xì)胞凍存
1、細(xì)胞凍存參數(shù)
2、貼壁細(xì)胞凍存流程：
（1）將胰酶、培養(yǎng)基提前37度預(yù)熱；凍存液提前配好放到4度冰箱預(yù)冷；
（2）先將裝有細(xì)胞的方瓶從培養(yǎng)箱拿出，用酒精噴灑瓶身后將搖瓶拿進(jìn)超凈臺(tái)；
（3） 打開(kāi)方瓶瓶蓋，將方瓶中的培養(yǎng)基倒干凈；
（4） 根據(jù)細(xì)胞消化難易程度添加適量的胰酶；T25方瓶加1 ml胰酶,T75方瓶加2ml胰酶；
（5） 根據(jù)細(xì)胞消化難易程度放入37度培養(yǎng)箱消化1-5 min，知道看見(jiàn)大片的細(xì)胞開(kāi)始脫落，要及時(shí)終止消化；
（6） 終止培養(yǎng)基需要含有至少10%血清，通常終止比例為1:10（1ml胰酶需要加入10 ml終止培養(yǎng)基），對(duì)胰酶比較敏感的細(xì)胞需要終止后離心后換新鮮的培養(yǎng)基；
（7） 終止后將細(xì)胞輕輕吹打混勻，避免結(jié)團(tuán)，細(xì)胞收集到15 ml或者50 ml離心管中，將離心管配平，放入離心機(jī)中1000 rmp5分鐘；
（8） 將離心管從離心機(jī)中取出，用酒精噴灑后拿進(jìn)超凈臺(tái)；
（9） 棄掉離心管中上清，加入預(yù)冷的凍存液，吹打混勻；
（10） 將混勻的細(xì)胞加入凍存管中；
（11）將凍存管放入凍存盒中，蕞后放入-80°冰箱；
（12） 第二天把細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮；
3、懸浮細(xì)胞凍存流程：
（1） 先將裝有細(xì)胞的搖瓶從培養(yǎng)箱拿出，用酒精噴灑瓶身后將搖瓶拿進(jìn)超凈臺(tái)；
（2） 打開(kāi)搖瓶瓶蓋，取適量細(xì)胞放入50 ml離心管或15 ml離心管中；
（3） 將離心管配平，放入離心機(jī)中1000 rmp5分鐘；
（4） 將離心管從離心機(jī)中取出，用酒精噴灑后拿進(jìn)超凈臺(tái)；
（5） 棄掉離心管中上清，加入提前預(yù)冷的凍存液，吹打混勻；
（6） 將混勻的細(xì)胞加入凍存管中；
（7） 將凍存管放入凍存盒中，蕞后放入-80°冰箱；
（8） 第二天把細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮；
