原代組織細胞的解離步驟
點擊次數：1190 更新時間：2021-08-12
原代組織細胞的解離從原代組織上獲取單個細胞懸液的常用方法是利用酶的解聚作用。盡量縮短用酶處理細胞的時間，以獲得高的存活率。按下面的方法解聚整個組織，以獲得大量細胞。
胰酶
1.先去除無關組織，然后用滅菌的解剖刀或剪刀將組織切成3-4mm大小碎塊。通過在不含鈣鎂的平衡鹽溶液進行重懸來清洗組織碎塊。待組織碎塊沉降后去掉上清液。重復清洗2-3次。
2.將裝有組織碎塊的容器置于冰上，去掉所有上清液。在不含鈣鎂的平衡鹽溶液中加入0.25%胰酶(每100mg組織大約需要1ml 胰酶)。
3.在4℃ 下孵育6-18小時，使低活性的胰酶盡量滲入組織。
4.緩慢倒掉胰酶。在37℃ 下將殘余的胰酶與組織碎塊共同孵育20-30分鐘。
5.向組織碎塊加入溫熱的*培養基，并輕輕地吹吸以分散組織。如果使用無血清培養基。還應加入大豆胰酶抑制劑。
6. 用滅菌的不銹鋼網(100-200μm)過濾細胞懸浮液，直至所有組織*散開。計算細胞個數，然后接種細胞進行培養。
膠原酶
1.用滅菌的解剖刀或剪刀將組織切成3-4mm大小碎塊。用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)將組織碎塊清洗數次。
2.加入膠原酶(50-200單位/ml膠原酶HBSS)。
3.在37℃ 下孵育4-18小時。加入3mM CaCl2 可以提高解離效率。
4.用滅菌的不銹鋼網或尼龍網過濾細胞懸浮液，將離散的細胞和組織片段與大塊的組織碎片分離。如需進一步解離，可向組織片段中加入新鮮的膠原酶。
5.通過離心HBSS清洗細胞懸浮液數次。
6.用培養基重懸細胞。計算細胞個數，然后接種細胞進行培養。
分散酶
1.用滅菌的解剖刀或剪刀將組織切成3-4mm大小碎塊。用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液清洗組織碎塊數次。
2.加入分散酶(0.6-2.4單位/ml分散酶不含鈣鎂的平衡鹽溶液)。
3.在37℃下孵育20分鐘至數小時。
4.用滅菌的不銹鋼網或尼友網過濾細胞懸浮液，將離散的細胞和組織片段與大塊的組織碎片分離。如需進一步解離，可向組織片段中加入新鮮分散酶。
5.通過離心平衡鹽溶液清洗細胞懸浮液數次。
6.用培養基重懸細胞。計算細胞個數，然后接種細胞進行培養。
