慢病毒包裝的技術原理及現狀
點擊次數：1030 更新時間：2021-08-17
慢病毒載體(Lentiviral vector)較逆轉錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產生表達siRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達siRNA/miRNA,實現在多種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產生特定基因表達降低的動物提供了可能性。慢病毒作為siRNA/miRNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達沉默的能力，而且充分發揮了慢病毒載體自身所具備的優勢，為基因功能的研究提供了更強有力的工具。
慢病毒包裝的原理
慢病毒(Lentivirus)是逆轉錄病毒的一種。構建的siRNA / miRNA慢病毒載體，與化學合成的siRNA 和基于瞬時表達載體構建的普通 siRNA 載體相比，一方面可以擴增替代瞬時表達載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆經過慢病毒包裝系統包裝后，可用于感染依靠傳統轉染試劑難于轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態的細胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩定表達。
慢病毒包裝的簡單流程
1) 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干擾載體的構建和質粒純化提取。
2) 慢病毒載體，包裝系統共轉染病毒包裝細胞293T等。
3) 培養 48hrs - 72hrs 左右，收集含you病毒的上清培養液。
4) 病毒的純化和濃縮。
5) 分裝，- 80 ℃保存。
6) 滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報告。
慢病毒包裝存在的問題
盡管慢載體的研究有了很大進展，但距離臨床應用還有很長的路要走。首先，重組病毒的滴度還不夠高，除Naldini等報道的結果外，其余均在101TU/ml~103TU/ml之間，難以達到體內應用的需要；其次，由于HIV復雜的生物學性質，要像目前常用的小鼠逆轉錄病毒載體那樣建立穩定的HIV載體包裝細胞十分困 難，已建立的包裝細胞均不理想。據報道，Vpr是一種使細胞進入靜止期的強誘導劑，也是建立包裝細胞的主要障礙之一。如果確如前文所述，包裝質粒中的vpr基因并非必需、去除后不影響載體的轉導能力，則建立穩定的包裝細胞是大有希望的。
在保證HIV-1載體的安全性上，迄今已做了種種努力，要產生有復制力的HIV,必須在不同的質粒上發生多次非同源重組事件。即使如此，一旦用于人體試驗，仍然不能打消人們對感染有復制力的HIV-1的顧慮。更為謹慎的做法是，以非人類的慢病毒為基礎構建載體，如猴免疫缺損病毒(SIV)、豬和牛免疫缺損病毒(FIV和BIV)、馬傳染性貧血病病毒等，而目前這些工作尚屬空白。
