ELISA不得不懂的實驗原理
點擊次數(shù)：615 更新時間：2021-08-19
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。
在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。
由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度類型及步驟
ELISA的主要常用類型及步驟
1. 間接法測抗體
間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體(二抗)以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2)加稀釋的樣本，保溫反應(yīng)。樣本中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
3)加酶標抗抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標抗抗體結(jié)合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關(guān)。
4)加底物顯色。
2. 雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢測抗原最chang用的方法，操作步驟如下：
1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2)加受檢樣本，保溫反應(yīng)。樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3)加酶標抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關(guān)。
4)加底物顯色。
3. 雙抗原夾心法測抗體
反應(yīng)原理和模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體
4.競爭法測抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。
