單細胞蛋白質組學：從小樣本中獲得大見解
點擊次數：728 更新時間：2021-11-11
以往，大量細胞分析提供了蛋白質、基因或代謝物的平均值。如今，單細胞分析正在揭示組織內各個細胞之間的差異。這些信息將有助于人們從細胞和分子層面上了解因果關系，也有助于解釋復雜的疾病狀態是如何產生并持續存在的。
大量細胞分析無法了解不同的細胞類型及其功能，它只能提供一個讀數，代表細胞的平均反應。這種平均值，不僅包括感興趣的特征(比如細胞表面標志物或其他表型)，還包括實驗假象和錯誤，因此混淆了特定細胞對這些事件的貢獻。
對蛋白質組學而言，單細胞分析的局限性在于樣本太小(單個細胞)以及它們所含的蛋白質數量極少。“獲取細胞不是問題，“問題在于，為了達到統計能力，您必須分析數百個或數千個細胞。每次LC/MC分析大約需要一小時，那么一項簡單的研究可能就需要十天左右，前提是一切都按計劃進行。”
此外，人類細胞會產生8萬到40萬種不同的蛋白質。并非所有蛋白都同時表達，有些是某個基本分子的不同亞型(isoform)。“大海撈針”的比喻也許是恰當的。單細胞蛋白質組學方法每天最多能分析300個細胞，對每個細胞中的2500個蛋白進行定量分析。
單細胞工作流程
單細胞流程當然也是從樣本處理開始。對樣本進行處理，使細胞分開和懸浮，然后通過熒光活化細胞分選(FACS)進行分離。單個細胞被分配到微量滴定板的各個孔中或芯片型分析系統上，在那里進行裂解。干擾質譜分析的裂解劑需要除去，但由于純化會導致樣本損失，因此研究人員盡量避免使用。
FACS是細胞分選的shou選方法，但也存在缺點。損失率高(有時非常高)，需要訓練有素的操作人員，而且購買和操作成本都很高。
當然，損失并不僅僅發生在細胞分選階段。“粘稠的蛋白質很難通過液相色譜(LC)分離，因此這個步驟也會造成損失。這將會進一步造成靈敏度問題或分析偏倚。有時，您只是無法從單個細胞的蛋白質中產生足夠的離子。”
為了解決這些靈敏度問題，一些操作方案將未標記的載體蛋白添加到混合物中，以緩解小樣本量帶來的損失。雖然這些方法有點用，但仍需要質譜技術的進步，特別是在電離效率方面的進步，才能處理小的樣本量和體積。
“如果沒有自動化液體處理系統，這些工作流程將無法實現，自動化系統帶來了準確的納升級流體操作，以及一致性和穩定性。”
早期對單細胞蛋白質組學的嘗試使用了基質輔助激光解吸電離(MALDI)，這是一種軟電離技術，可以保留不穩定的分子特征，并最大限度減少樣本損失和樣本制備步驟。
基于MALDI的方法是在上世紀90年代shou次使用的。人們采用MALDI作為離子源，并用飛行時間(TOF)作為質量分析器，從而提供一種功能性的單細胞分析。不過，這些技術存在三個主要缺點：MALDI不能在時域內分離肽段，無法對大量蛋白質進行測序，而且MALDI電離的可變性會影響定量的準確性。
另一種電離蛋白質的方法，電噴霧電離(ESI)，則更容易實現測序，因為它很容易與各種分離方法(如毛細管電泳)相結合。然而，ESI需要大量的樣本制備，這可能導致損失，讓人們無法接受。
應對未來的挑戰
單細胞蛋白質組學也許更適合勇敢的人。這項技術還需要很多工作，才能滿足成本、靈敏度、穩定性和可靠性等方面的需求，應用于日常科研、生物制造和診斷。
“不過在此之前，人們必須解決單細胞分離的挑戰，以及驗證質譜技術和流程的挑戰。此外，臨床背景下的技術人員還需要更多的全面整合流程。目前運行16個樣本大約需要兩到三個小時，這也需要改進。”
