實驗天天做，蛋白還是表達不好？
點擊次數：616 更新時間：2021-11-19
哺乳動物表達系統克服了原核表達系統翻譯后修飾蛋白表達的問題。表達的蛋白具備折疊和修飾的功能，高度人源化，可以用于結構、功能分析。利用哺乳動物細胞表達蛋白通常有兩種方式：瞬時表達與穩定轉染(構建穩定細胞系)。利用細胞穩定轉染將外源基因轉染至細胞染色體上，能夠長期穩定地生產目的蛋白。但是實驗成本高、周期長、操作難度大。
瞬時蛋白表達是指外源基因存在于游離的載體上，并沒有轉染到細胞的染色體。構建好質粒后，經過細胞復蘇、轉染、細胞培養、蛋白純化等步驟即可得到目的蛋白。操作簡單，實驗成本低，周期短，最shi合應用于快速、小規模制備一定量的重組蛋白和重組抗體。
快來看看如何提高瞬時蛋白表達吧！
策略一 ：優化編碼序列
根據特定的下游應用設計最佳的編碼序列并選擇最合適的表達載體。在開始蛋白表達之前，使用密碼子優化算法 (如OptimumGene?或GenSmart Codon Optimization) 以及表達載體選擇指南 (如金斯瑞的GenSmart? Design工具) 可節省時間、精力和費用。你知道嗎？金斯瑞可提供從基因合成(免費的密碼子優化)到蛋白表達、純化等一體化服務！
策略二：提高蛋白溶解度
較低的蛋白質溶解度是造成重組蛋白表達產量低的一個關鍵因素。我們建議首先調整一些常用的表達條件參數來提高蛋白質的溶解度。
溫度
對于HEK293和其它哺乳動物細胞系，建議在37°C、5% CO2孵箱中培養細胞。有些研究表明，在轉染后24小時將溫度從37°C降至33°C培養，可提高HEK293細胞的蛋白表達。
盡管不同供應商提供的基礎培養基十分類似，但它們之間的微小差異可能會影響特定表達細胞系的生長。一定要優化外部成分的濃度、pH值、類型甚至是批次或批號，如添加到培養基中的血清。
培養基
培養基添加劑
在某些情況下，我們建議向培養基中添加特定的試劑來提升蛋白表達。例如添加組蛋白脫乙酰基酶抑制劑，使染色質解聚并增加整合基因的轉錄活性。或者，向培養基中加入特定的生長因子有助于提高蛋白產量。
策略三：使用融合伴侶
蛋白標簽是插入到重組蛋白上的短肽序列，可以用于提高蛋白表達。通常會在蛋白表達結束時采用酶切或化學試劑去除。表1列舉了常用的蛋白標簽類型及其優缺點。
表1：常用標簽列表
針對特定表達系統選擇合適的標簽取決于多種因素。如果目標是獲得*的產量，則需要使用助溶標簽，比如GST有很強的翻譯起始信號，能促進高水平的表達。但是，如果需要較低的表達水平，建議使用更嚴格的表位標簽，如His標簽。
策略四：優化純化方法
根據下游應用和純度要求設計不同的純化方法。如果蛋白表達量高，那么使用一步式親和純化方法就能獲得足夠量和純度的蛋白，滿足各種下游應用。如果需要進一步純化，親和純化后通常可以進行分子排阻色譜(Size Exclusion Chromatography, SEC)。如需更進一步純化，則可使用離子交換色譜 (Ion Exchange, IEX) 。
