酶聯免疫吸附(ELISA)實驗原理介紹
點擊次數：1299 更新時間：2021-11-29
ELISA，即酶聯免疫吸附實驗，其基本原理是將一定濃度的抗原或者抗體通過物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待檢標本，通過酶標物顯色的深淺間接反映被檢抗原或者抗體的存在與否或者量的多少。ELISA技術作為免疫標記技術(包含免疫熒光技術，免疫放射技術，免疫酶技術和免疫膠體金技術)中的一種，已廣泛應用于科研和臨床實驗中，具有快速、定性或者定量甚至定位的特點。
ELISA可用于測定抗原，也可以測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體；②酶標記的抗原或抗體；③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢驗方法。
一、雙抗體夾心法
雙抗體夾心法，其基本原理是將一定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入無關蛋白載體封閉未結合位點，然后加入含有抗原之待測樣品，通過加入酶標記特異性抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈正相關。該方法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
二、競爭法
競爭法一般分為直接競爭法和間接競爭法，這里我們以直接競爭法為例進行原理講解。直接競爭法，其基本原理是：將合適濃度的包被抗體包被于微孔板中，加入無關蛋白載體封閉未結合位點，加入標準品(樣本)和生物素標記的抗原物質進行競爭結合，經合適的溫度和一定時間的孵育，洗滌后，加入HRP標記的鏈霉親和素進行反應，TMB顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈負相關。該方法一般用來檢測具有較少表位的小分子物質，當然，這種方法也可以用來檢測大分子抗原物質甚至是抗體。檢測大分子抗原物質時，由于空間位阻的影響，使得該檢測方法沒有雙抗體夾心法檢測大分子抗原物質靈敏度高。
三、間接法測抗體
間接法一般用來檢測抗體。其基本原理是：將一定量的抗原物包被于聚苯乙烯微孔板，加入無關蛋白載體封閉未結合位點后，加入待測樣本，然后加入酶標二抗，經孵育和洗滌后，加底物顯色。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗體檢測各種與抗原相應的抗體。主要用于對病原體的檢測而進行傳染病的診斷。
四、雙抗原夾心法測抗體
雙抗原夾心法，與雙抗體夾心法類似，基本原理是將已知濃度的抗原固定于聚苯乙烯微孔板表面，對未結合位點用無關蛋白載體進行封閉后，加入待檢樣本，然后加入生物素標記的抗原和HRP標記的鏈霉親和素，經TMB顯色和終止反應，酶標儀讀數之后即可計算待測物濃度。雙抗原夾心法與間接法都可以對抗體進行檢測。
五、捕獲法測抗體
由于我們檢測樣本中的IgM含量時，其中同時含有較高濃度的IgG類抗體，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法。其基本原理是：將抗IgM抗體包被于固相微孔板，用無關蛋白載體對未結合位點進行封閉后，加入待測樣本，接著加入抗原物質，然后加入針對該抗原的經生物素標記的特異性抗體和HRP標記的鏈霉親和素，經TMB底物顯色和終止反應后即可計算濃度。
