遠慕教您如何提高抗體純化效率
點擊次數：661 更新時間：2021-12-16
提高抗體純化效率一方面可以通過優化現有純化工藝設備、方法和工藝，挖掘現有純化技術的潛力。另一方面則可以通過開發創新性的介質和工藝，從根本上突破現有技術障礙。
抗體分離純化的主要目的是將抗體與工藝相關雜質和產品相關雜質分離，最終獲得高純度、低潛在危害的抗體藥物。
純化過程中需要去除的工藝相關雜質包括細胞、細胞碎片、宿主細胞蛋白、宿主細胞核酸及培養基與加料液成分，需去除的產品相關雜質主要包括抗體片段和聚集體。純化過程還需具備足夠的病毒滅活去除能力，以去除宿主細胞自身表達的內源病毒樣顆粒和未及時發現的外源病毒。
大多數工藝利用ProteinA來捕獲抗體，并利用了至少1個離子交換層析作為精純步驟，僅少數工藝使用了疏水、羥基磷灰石和分子篩層析等步驟。
圖1中顯示了一個常見的抗體純化工藝。反應器收獲液首先經過離心和過濾，去除細胞和細胞碎片，然后經過ProteinA層析捕獲抗體,捕獲后的抗體經低pH孵育后，通過兩個離子交換層析進行精純,然后進行病毒過濾，最后換液并調整抗體濃度，得到抗體原液。
工藝中的低pH孵育和病毒過濾是兩個正交的專屬病毒去除滅活步驟。這兩個專屬步驟與層析步驟一起，可大大降低原液中可能存在的病毒數目。
第一話 離心、過濾
抗體為胞外分泌型表達，純化的第一步是將培養液上清與細胞及細胞碎片分離開來。在實驗室規模，分離可通過簡單批次離心完成，但大規模抗體生產主要采用連續分離的方法，主要包括深層過濾、切向流過濾和連續流離心。
深層過濾的優點是簡單易用，前期投入低。深層過濾介質的孔徑分布較廣，內表面積大，可依靠孔徑截留和內表面吸附雙重作用去除固體顆粒，比單一孔徑濾器能處理更大量的固體雜質，且流速更快。
深層過濾系統由一系列的濾器組成，介質的孔徑從上游到下游遞減(見圖2)。深層過濾本身不能達到無菌過濾，所以過濾系統的最后一級通常需要一個無菌濾器。深層過濾介質中含有硅藻土，硅藻土在抗體純化條件下帶正電荷，在去除細胞和細胞碎片的情況下，還可以去除部分帶負電荷的宿主細胞核酸和宿主細胞蛋白質，起到初步純化的作用。
深層過濾的缺陷是一次性濾芯使用費用高和處理量有限，在處理大體積培養液時需并聯多個濾器，費用和占地面積顯著增加，所以深層過濾的試用范圍限于100-2000L的中試規模的抗體純化。
切向流濾器在灌流反應器部分較為常用(見圖3)，其高切向的流速可減少細胞在膜表面的沉積，從而可以處理大體積細胞培養液而不造成膜的堵塞。
切向流的流速越高，細胞沉積越少，但同時帶來的剪切力越高，細胞破碎風險越大。細胞破碎形成的細胞碎片更容易阻塞濾芯，并且細胞破碎釋放的胞內蛋白和核酸將大大增加后續純化步驟的壓力。
切向流濾器的使用以中空纖維最為普遍，其表面積大，又可以在孔腔內形成高剪切力。中空纖維濾器的工藝放大可通過增加纖維數目完成，簡單易行。
在切向流過濾工藝開發和優化方面，需要考慮的包括濾芯化學成分、濾芯表面積、孔徑、切向流流速、跨膜壓力。
切向流過濾存在死體積，可在過濾后期加人少量緩沖液，降低死體積中的抗體含量，減少抗體損失。切向流過濾處理量大，可用于超過10000L細胞培養的分離，達到每小時近5000L的液體處理量。其局限在于濾器費用較高，過濾時間較長，并且過濾速度的可控性低。
連續流離心，尤其是采用碟片式離心機進行的連續流離心，是大規模抗體生產中主要采用的分離模式。
碟片式離心機腔體為錐形，細胞培養收獲液在靠近軸部加入，離心后上清液從軸部附近排出，細胞在離心力作用下，在錐形的底部邊線附近聚集結塊。
腔體定期在細胞聚集處輕微開啟，利用腔體內的壓力將細胞排出。細胞排出夾帶的液體損失可通過離心力(轉速)、腔體開啟頻率和開啟時間的優化，控制在5%以下。
連續流離心能夠去除絕大部分細胞和細胞碎片。殘留的少量細胞碎片可用深層過濾去除。碟片式離心機的優點是體積小，多層碟片形成的沉降面積大，液體處理量大，操作簡單、可靠，使用費用低。其缺點是前期設備投資髙，清洗較復雜，并缺少合適的小試模型。
連續流離心機與沉降器一樣利用細胞與培養基的密度差實現固液分離。圖4顯示的是一個商業化的碟片式連續流離心機。細胞培養液自離心機底部進料，在離心力的作用下，細胞在腔體的最外圍富集。
上下腔體周期性地短暫打開，釋放清除腔體內積累的細胞，這部分細胞返回反應器。細胞培養液上清自離心機頂端收獲。連續流離心分離速度快，液體處理量大，可實現高達3600L/d的灌流速度，細胞分離效果高于90%，有很好的應用前景。
連續流離心機的弱點是設備和操作相對復雜，機械和操作故障風險相對較高。同時離心時形成的細胞團有可能造成局部營養缺失或副產物積累，其程度和影響需進一步考察。連續流離心機在操作時還需考慮細胞的剪切力耐受性，避免細胞損傷。
