如何有效避免RNase污染看這篇
點擊次數(shù)：630 更新時間：2022-01-14
自然界中許多生物會自主分泌RNase
RNase是生物體的“保護傘”，可防止外源RNA入侵。如：生物眼淚、唾液、汗液等體液中均會分泌RNase。
環(huán)境中的RNase穩(wěn)定性非常好
環(huán)境中存在的RNase主要是由微生物(細菌和真菌)所分泌，由一種微小緊湊的蛋白組成。它的結(jié)構(gòu)中具有二硫鍵，因此具有穩(wěn)定性ji強的天然屬性，極難滅活，熱變性后也可以很快恢復(fù)構(gòu)象。并且，RNase耐熱、耐酸、耐堿，因此，它對眾多去污方法均具有抵抗作用。
檢測RNase污染的小Tips
由于RNase污染而導(dǎo)致實驗失敗，如何有效檢測RNase污染源，是令實驗人員頭疼的事情。建議從以下幾點進行排查：
檢測緩沖體系、溶液：可啟用全新批次的RNase-free試劑測試比對，也可檢測疑似污染溶液中的RNase。
檢測RNA樣品：RNase進入RNA樣本可在多種情況下發(fā)生，如RNA分離時(少量RNase在RNA制備過程中引入)，或日常取用時(會不可避免地需要重復(fù)開關(guān)樣品管并插入可能被污染的加樣槍頭)。
可用GAPDH、cyclophilin、或beta-actin等管家基因的探針，通過northern分析來評估poly(A)RNA樣品的完整性。
從源頭開始，避免RNase的污染
RNase的無處不在，使得實驗過程中，難以保存RNA樣本的完整性。因此，可以從源頭入手，一方面要嚴格控制外源性RNase的污染，另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNase。
常見的污染源及其控制方法：
外源性
外源性污染源：
體液、水與緩沖液等溶液，槍頭，離心管。
控制外源性RNase污染的方法：
操作人員全副武裝
在實驗過程中戴手套可避免源自人手的RNase污染；觸摸皮膚、門把手及普通物體表面后更換手套；
使用專業(yè)儀器與試劑
RNA操作專用的移液槍；使用RNase-free的槍頭和離心管；使用RNase-free的化合物與試劑；
選擇實驗操作環(huán)境
遠離/遮蔽通風孔或開放窗口，走動較少的區(qū)域作為RNase-free區(qū)域；
其他注意的點
在RNA提取和分析期間，不要進行其他可能引起RNase污染的實驗。
內(nèi)源性
內(nèi)源性污染源：
所有組織樣品均含有內(nèi)源性RNase。
抑制內(nèi)源性RNase活性的方法：
樣本保存
組織取樣后若不直接提取RNA，要及時用液氮迅速冷凍存于-80°C環(huán)境，并盡早進行實驗，這樣可使RNA的降解達到最少。
添加抑制劑
在細胞裂解液中加入RNase抑制劑(RNaseinhibitor)，使破碎細胞與滅活RNase同步進行，最大限度地降低細胞破碎過程中所釋放的RNase的活性。
遠慕RNase抑制劑可有效避免RNase污染
RNasin能夠保護mRNA的完整，有利于提高轉(zhuǎn)錄及翻譯的效率，同時避免了使用有機化合物抑制劑可能帶來的影響。
RNasin是從人胎盤或大鼠肝中提取的一種特異的酸性糖蛋白。其分子量為51kDa，等電點pH值為4.7。RNasin對RNaseA、RNaseB或RNaseC抑制能力ji強，可快速特異地與它們以非共價鍵結(jié)合形成1:1的復(fù)合物，從而抑制RNase的活性，防止RNA被其降解。但需注意，RNasin不能抑制RNaseI、T1、T2、H、U1、U2和CL3的酶活性。
目前，RNasin主要用于cDNA合成，體外轉(zhuǎn)錄，體外翻譯，以及mRNA-protein復(fù)合物分離純化等過程中保護RNA不被降解；還可用于特定RNase活性的鑒定等。
