作標(biāo)準(zhǔn)曲線是否真的那么簡(jiǎn)單？
點(diǎn)擊次數(shù)：649 更新時(shí)間：2022-02-14
分析檢測(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線目的是可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待測(cè)物質(zhì)的含量。所以標(biāo)曲的制定是實(shí)驗(yàn)室工作中bi不可少的工作，那么，你所做的標(biāo)曲真的做好了嗎?RSD值、線性相關(guān)系數(shù)和線性方程如何?線性好與不好分別由于哪些原因造成的?是儀器、標(biāo)液，還是配制的問(wèn)題?對(duì)比下文的一些點(diǎn)來(lái)找找原因吧!
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作要求
按GB/T22554-2010《基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn)》推薦：1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍應(yīng)覆蓋正常操作條件下的被測(cè)量范圍;2、標(biāo)準(zhǔn)樣品的組分盡量與被測(cè)樣品組分一致;3、標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度值應(yīng)等距離的分布在被測(cè)量范圍;4、標(biāo)準(zhǔn)樣品的個(gè)數(shù)至少應(yīng)有3個(gè)濃度;5、每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)至少重復(fù)2次，這個(gè)重復(fù)是指從稀釋開(kāi)始;如果國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有相應(yīng)的濃度系列推薦，盡量按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，如果你要偷懶，比如我要減少標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，至少要有理論標(biāo)準(zhǔn)支撐，比如至少要3個(gè)濃度。工作中我們經(jīng)常采用線性校準(zhǔn)，因?yàn)榫€性方程最為簡(jiǎn)潔。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的作法
(1)標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測(cè)樣品的可能變異最di與最高值，一般可選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級(jí)增加，并應(yīng)與被測(cè)液同樣條件下顯色測(cè)定。
(2)標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定：在比色時(shí)，讀取光密度至少讀2-3次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生的誤差。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制：一般常用的是光密度--濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
①用普通方格紙作圖。圖紙最好是正方形(長(zhǎng)：寬=l：1)或長(zhǎng)方形(長(zhǎng)：寬=3 ：2)，以橫軸為濃度，縱軸為光密度，一般濃度的全距占用了多少格，光密度的全距也應(yīng)占用相同的格數(shù)。
在適當(dāng)范圍內(nèi)配制各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，求其光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度位置向上延長(zhǎng)，光密度位置向右延長(zhǎng)、交點(diǎn)即為此座標(biāo)標(biāo)點(diǎn)。然后，將各坐標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)聯(lián)成一條線，若符合Lambert-Beer氏定律，則系通過(guò)原點(diǎn)的直線。
②若各點(diǎn)不在一直線，則可通過(guò)原點(diǎn)，盡可能使直線通過(guò)更多點(diǎn)，使不在直線上的點(diǎn)盡量均勻地分布在直線的兩邊。
③標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制完畢以后，應(yīng)在座標(biāo)紙上注明實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的名稱(chēng)，所使用比色計(jì)的型號(hào)和儀器編號(hào)、濾光片號(hào)碼或單色光波長(zhǎng)以及繪制的日期、室溫。
④繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：一般應(yīng)作二次或三次以上的平行測(cè)定，重復(fù)性良好曲線方可應(yīng)用。
⑤繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線只能供以后在相同條件下操作測(cè)定相同物質(zhì)時(shí)使用。當(dāng)更換儀器、移動(dòng)儀器位置、調(diào)換試劑及室溫有明顯改變時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線需重新繪制。
⑥標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)的標(biāo)度：從標(biāo)準(zhǔn)液的含量換算成待測(cè)液的濃度。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的核心問(wèn)題要解決
1、能找到確切濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)品。
2、標(biāo)準(zhǔn)系列和待測(cè)物質(zhì)一定要有相同和一致的基體，因?yàn)闃悠坊w可能會(huì)干擾儀器的響應(yīng)，從這個(gè)意義上講，樣品的前處理實(shí)際就是提供標(biāo)準(zhǔn)和樣品同樣的基體環(huán)境，盡量祛除干擾基體。所以最hao的標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)該是樣品基體匹配的標(biāo)準(zhǔn)系列。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作注意事項(xiàng)
對(duì)于分析定量來(lái)說(shuō)，如果標(biāo)線沒(méi)有做好，那么即使前處理做的再好，回收率再好，也會(huì)使你的結(jié)論失去一定的參考價(jià)值!也失去了與其他人員測(cè)試數(shù)據(jù)的可比性!要做好定量工作除了儀器正常外，我們也要配制好一條好的標(biāo)線：
1.首先盡量選取有證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不管是直接要用的母液還是要配置成母液的其他物質(zhì)(如固體，粉末等)!選取有證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是為了大家都有一個(gè)共同的基準(zhǔn)(量值溯源)!如果實(shí)在是在沒(méi)有有證書(shū)的母液條件下，就用有證書(shū)的其他物質(zhì)來(lái)配置!如果有就最好用有證書(shū)的物質(zhì)，因?yàn)樽约号渲玫哪敢簳?huì)帶來(lái)一定的誤差!
2.在配置時(shí)要把所有要用到的工具(容量瓶、移液槍、移液管等)進(jìn)行校正，最好拿到國(guó)家計(jì)量中心或有資質(zhì)的部門(mén)校正!有校正能力的實(shí)驗(yàn)室也可自己校正!
3.防止污染!要洗凈所要用到的工具!對(duì)于離子色譜來(lái)說(shuō)，主要使用去離子水清洗!
4.配制好標(biāo)液后，及時(shí)上機(jī)，避免有的物質(zhì)不穩(wěn)定或易被污染!
但在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中也只有常規(guī)分析的時(shí)候，相對(duì)比較容易些，而現(xiàn)目前不少實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目均要求檢測(cè)ppb級(jí)含量的物質(zhì)，IC是很容易引入污染的(Cl、Na等)。跨越幾個(gè)數(shù)量級(jí)時(shí)，線性系數(shù)雖然很好，但是RSD值卻很大，痕量分析的定量誤差是相當(dāng)?shù)拇蟆?br />
5.選取合適的方程。根據(jù)物質(zhì)的和檢測(cè)器的特性，選取合適的線性方程。(比如是否要強(qiáng)制過(guò)原點(diǎn)，是直線還是二次方程等)
6.檢查線性是否合格。除線性本身的一些參數(shù)：RSD值是否小于一定值比如(5%)，線性相關(guān)系數(shù)是否達(dá)到比如四個(gè)九以上，如果不是強(qiáng)行過(guò)原點(diǎn)的一次方程的節(jié)距是否合理等外，還要檢查濃度的準(zhǔn)確性，因?yàn)橐欢舛鹊哪敢海匆欢ū壤♂尪伎沙梢欢ň€性的，但濃度就不一定就是所需要的!所以光看線性好，是不能代表所做的標(biāo)線就是合格的。
7.標(biāo)線的準(zhǔn)確性除儀器自身的回收率、響應(yīng)值等相關(guān)外，另外我們可以做到：
⑴不同的人員配置標(biāo)線和QC;
⑵防止母液是否有問(wèn)題，要做標(biāo)液的新舊對(duì)比或者不同的牌子的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(參考物質(zhì))進(jìn)行監(jiān)控和或使用或次級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(參考物質(zhì))開(kāi)展內(nèi)部質(zhì)量控制;
⑶參加實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)或能力驗(yàn)證;
⑷使用相同或不同方法進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)或校準(zhǔn);
⑸對(duì)存留物品進(jìn)行再檢測(cè)或再校準(zhǔn)
8.標(biāo)線合格后，還要通過(guò)QC等觀察標(biāo)線的使用壽命!
常見(jiàn)問(wèn)題：
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線需要人為的增加(0,0)點(diǎn)嗎?
不能。通常的標(biāo)準(zhǔn)系列多是配制0,1,2,3mg/L系列這樣的說(shuō)法，沒(méi)做實(shí)驗(yàn)人為添加(0,0)很不妥，因?yàn)楹芏鄷r(shí)候0管進(jìn)入儀器可能也有響應(yīng)值，這也是我們考察試劑空白的一個(gè)重要步驟。這個(gè)0管在某些時(shí)候非常重要，比如全血鉛測(cè)定，我們采用牛血清來(lái)基體匹配標(biāo)準(zhǔn)系列，如果此時(shí)你用酸做空白或沒(méi)做實(shí)驗(yàn)人為添加(0,0)，那你就很難做好標(biāo)準(zhǔn)曲線。所以標(biāo)準(zhǔn)曲線的0管也是做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的重要考慮點(diǎn)。
2 標(biāo)準(zhǔn)曲線需要減掉試劑空白來(lái)做嗎?
不需要。儀器測(cè)出來(lái)標(biāo)準(zhǔn)系列的響應(yīng)值可以減掉試劑空白或減掉0管的響應(yīng)值來(lái)做，工作中我們也常用0管來(lái)做儀器調(diào)零。其實(shí)沒(méi)有必要那么麻煩，即使空白或0管有響應(yīng)值，在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，我們已經(jīng)認(rèn)為該響應(yīng)值就是0濃度，也就是扣除了這個(gè)空白的。
3 什么時(shí)候用Y=bX和二次曲線呢?
標(biāo)準(zhǔn)曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，且要做統(tǒng)計(jì)完備的線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，然后再做a與0的差別檢驗(yàn)，如果a與0的統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來(lái)后同樣做線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，如果線性檢驗(yàn)合格(P<0.05)且失擬檢驗(yàn)合格(P>0.05)此時(shí)你就可以采用Y=bX。二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時(shí)擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗(yàn)，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上參數(shù)最少的統(tǒng)計(jì)簡(jiǎn)潔性原則。
4 標(biāo)準(zhǔn)曲線去查含量時(shí)是先減空白信號(hào)算樣品含量還是先算出空白含量相減呢?
工作中我們常要減掉空白得到樣品含量，現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法有的推薦先算出空白含量，用樣品含量相減，也有推薦先用樣品信號(hào)減空白信號(hào)然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量。而且這兩種算法常常差距很大。其實(shí)這種差距往往是低含量水平時(shí)才出現(xiàn)，在低含量水平通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)，本身不確定度就很大。這兩種方法都可以。個(gè)人推薦先用樣品信號(hào)減空白信號(hào)然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量，因?yàn)檫@樣出來(lái)的含量不確定度要小一些，而先算出空白含量再相減就增加了1次標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)的不確定度，因?yàn)楹玫臏y(cè)量永遠(yuǎn)是不確定度小的測(cè)量。
標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法區(qū)別?標(biāo)準(zhǔn)曲線法：
也稱(chēng)外標(biāo)法或直接比較法，是一種簡(jiǎn)便、快速的定量方法。與分光光度分析中的標(biāo)準(zhǔn)曲線法相似，首先用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體方法是：用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與待測(cè)組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確進(jìn)樣，測(cè)量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對(duì)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，此標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)是通過(guò)原點(diǎn)的直線。若標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過(guò)原點(diǎn)，則說(shuō)明存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率即為絕對(duì)校正因子。
在測(cè)定樣品中的組分含量時(shí)，要用與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線*相同的色譜條件作出色譜圖，測(cè)量色譜峰面積或峰高，然后根據(jù)峰面積和峰高在標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接查出注入色譜柱中樣品組分的濃度。
標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點(diǎn)是：繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后測(cè)定工作就變得相當(dāng)簡(jiǎn)單，可直接從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上讀出含量，因此特別適合于大量樣品的分析。
標(biāo)準(zhǔn)曲線法的缺點(diǎn)是：每次樣品分析的色譜條件(檢測(cè)器的響應(yīng)性能，柱溫，流動(dòng)相流速及組成，進(jìn)樣量，柱效等)很難*相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。此外，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時(shí)，一般使用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品(或已知準(zhǔn)確含量的樣品)，而實(shí)際樣品的組成卻千差萬(wàn)別，因此必將給測(cè)量帶來(lái)一定的誤差。
標(biāo)準(zhǔn)加入法，又名標(biāo)準(zhǔn)增量法：
是一種被廣泛使用的檢驗(yàn)儀器準(zhǔn)確度的測(cè)試方法。這種方法尤其適用于檢驗(yàn)樣品中是否存在干擾物質(zhì)。
具體方法是：將一定量已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入待測(cè)樣品中，測(cè)定加入前后樣品的濃度。加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后的濃度將比加入前的高，其增加的量應(yīng)等于加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液中所含的待測(cè)物質(zhì)的量。如果樣品中存在干擾物質(zhì)，則濃度的增加值將小于或大于理論值。
總的來(lái)說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法適用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的基體和樣品的基體大致相同的情況，優(yōu)點(diǎn)是速度快，缺點(diǎn)是當(dāng)樣品基體復(fù)雜時(shí)不正確。標(biāo)準(zhǔn)加入法可以有效克服上面所說(shuō)的缺點(diǎn)，因?yàn)樗前褬悠泛蜆?biāo)準(zhǔn)混在一起同時(shí)測(cè)定的，但他也有缺點(diǎn)就是速度很慢。標(biāo)準(zhǔn)曲線法可在樣品很多的時(shí)候使用，先做出曲線，然后從曲線上找點(diǎn)，那樣方便。標(biāo)準(zhǔn)加入法，適合數(shù)量少的時(shí)候用。
