做ELISA實(shí)驗(yàn)，有幾種常見的實(shí)驗(yàn)方法，他們分別是競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法、間接法、夾心法、而夾心法又可以分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法！在今天的文章中，遠(yuǎn)慕生物將詳細(xì)得跟大家講述競(jìng)爭(zhēng)法的實(shí)驗(yàn)原理！
競(jìng)爭(zhēng)法一般分為直接競(jìng)爭(zhēng)法和間接競(jìng)爭(zhēng)法，這里我們以直接競(jìng)爭(zhēng)法為例進(jìn)行原理講解。直接競(jìng)爭(zhēng)法，其基本原理是：將合適濃度的包被抗體包被于微孔板中，加入無關(guān)蛋白載體封閉未結(jié)合位點(diǎn)，加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和生物/素標(biāo)記的抗原物質(zhì)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，經(jīng)合適的溫度和一定時(shí)間的孵育，洗滌后，加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行反應(yīng)，TMB顯色，微孔板中顏色的深淺與待測(cè)物的濃度呈負(fù)相關(guān)。
該方法一般用來檢測(cè)具有較少表位的小分子物質(zhì)，當(dāng)然，這種方法也可以用來檢測(cè)大分子抗原物質(zhì)甚至是抗體。檢測(cè)大分子抗原物質(zhì)時(shí)，由于空間位阻的影響，使得該檢測(cè)方法沒有雙抗體夾心法檢測(cè)大分子抗原物質(zhì)靈敏度高。這種方法在檢測(cè)抗體時(shí)，可能由于兩種競(jìng)爭(zhēng)的抗體來源不一，導(dǎo)致兩種抗體趨同性不高，就使得檢測(cè)結(jié)果的可靠性不高。
當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)。抗HBe的檢測(cè)一般采用此法。
實(shí)驗(yàn)步驟
以稀釋液將待檢標(biāo)本做適當(dāng)稀釋（預(yù)試中確定）加入包被有已知抗原的酶標(biāo)板中（50ul/孔），加封口膠帶于37℃作用30min。
2. 棄反應(yīng)液，以沖洗液連續(xù)洗板5次并于吸水紙上拍干。
3. 加入酶標(biāo)抗體（濃度在預(yù)試中確定）。加封口膠帶后于37℃作用30min。
4. 重復(fù)第2步。
5. 加底物（濃度在預(yù)試中確定），加封口膠帶后于室溫下避光作用5-60 min，其間不時(shí)觀察，顯色滿意后加終止液50ul/孔。
6. 于酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，OPD用492nm測(cè)定，TMB用450nm測(cè)定。
注意事項(xiàng)
每次實(shí)驗(yàn)均應(yīng)做陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照（以PBS代替標(biāo)本），后者為本底值，在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)扣除本底值，陽(yáng)性對(duì)照<陰性對(duì)照<空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)成立。
2. 一般認(rèn)為小分子抗原宜用本法檢測(cè)，而大分子抗原則宜采用夾心法檢測(cè)，但具體宜采用哪種方法應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)決定，本發(fā)與夾心法相比在操作上減少一步。包被抗體與酶標(biāo)抗體如果分別采用單克隆抗體和多克隆抗體時(shí)，宜用單克隆抗體作為包被抗體，以多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體。
3. 血清標(biāo)本中抗原濃度一般較低，故一般用原倍標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)可進(jìn)行稀釋測(cè)定，但應(yīng)重新摸索酶標(biāo)抗原的濃度，以確保方法的靈敏性。
4. 以酶標(biāo)記抗原的方法同酶標(biāo)記抗體。
5. 其它注意事項(xiàng)同酶聯(lián)免疫間接法。
