PCR產物的直接純化：
一、原理
PCR產物一般都含有過量的引物、 Taq DNA酶及dNTP，這些成分的存在將直接影響到后續的酶切、雙脫氧PCR測序反應等過程,因此有必要除去。目前核酸純化的方法有很多,商用化試劑盒的出現使得DNA的純化過程變得更加簡便快捷。本實驗中, Buffer PCR-A促使大于100bp的DNA片斷選擇性地吸附到 silica膜上。經 Buffer W. BufferW2洗滌去除殘留在sica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、單核苷酸、熒光染料或放射性同位素標記的單核苷酸后,吸附到sica膜上的DNA片斷經微量水或 Eluent洗脫下來,即可用于各種分子生物學的操作。
二、材料與方法
1、材料PCR產物
2、儀器、用具
恒溫孵育器(65C)、離心機、移液器、1.5ml離心管
3、試劑
Buffer_PCR -A Buffer w1；已加無水乙醇的 Buffer V2 Eluent或去離子水
4、方法
(1)在PCR反應液中加入3倍體積的 Buffer PCR-A若需加入的 BufferPCR-A不足100ul,則加入100ul。
(2)將DNA --prep Tube置于2 -ml Microfuge Tube中,將步驟(1)中的混合液移入DNA -prep Tube I中,5500rpm離心1min。
(3)棄濾液,將DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube中,加入500 ul Bufer W1,5500rpm離心1min。
(4)棄濾液,將DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube中,加入700山已加無水乙醇的 Buffer V2,5500rpm離心1min,以同樣的方法再用700山己加無水乙醇的 Buffer\2洗滌一次。
(5)棄濾液,將DNA -prep Tube置回到原2 -mi Microfuge Tube中1400opm離心1min
(6)連濾液一并棄掉收集管,將DNA -prep Tube置于一新的1.5ml離心管中,在sia膜中央加入25-30 ll Eluente或去離子水(65℃預熱)
(7)室溫靜置2min,1400opm離心1min洗脫DNA。
(8)取5山樣品,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化結果
PCR產物切膠回收:
1、在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠,計算凝膠重量。(100mg凝膠,計100ul體積)(盡量縮短暴露UV燈下的時間）。
2、加入3個凝膠體積的 Buffer DE-A(600uD,混合均勻后,于65°C加熱,直至凝膠*熔化。
3、加0.5個 Bufifer DE-A體積的 Buffer DE-B(300uD,混合均勻,當分離的DNA片段小于400bp時,加入1個凝膠體積的異丙醇。
4、吸取3中的混合液,轉移到DNA制備管(置于2ml離心管中),12,000×g離心1min棄濾液。
5、將制備管置回2ml離心管中,加500 ul Buffer W,12,000×g離30sec棄濾液。
6、將制備管置回2ml離心管中,加700 ul Buffer W2,12000×g離心30sec棄濾液。重復一次。
7、將制備管置回2ml離心管中,12,000Xg離心1min*去除殘余的液體。
8、將制備管置于1.5ml離心管中,在制備膜中央,加25~30ul65 Eluent或去離子水,室溫靜置1min。12,000×g離心1min洗脫DNA
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