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1.因為WB的一抗識別的蛋白質的表位是順序表位，不是空間表位，所以WB狀態下的抗原-抗體識別，與非變性的生理條件下的抗原-抗體識別不同。

2.WB之前，先用分子篩純化同時也是檢測一下目的蛋白產物是否成功。也就是目的蛋白是否成功表達了，而且在提取后穩定存在了。

3.非特異性的條帶分子量偏大可能是SDS PAGE出的問題，膠的濃度不合適或者樣品溶解度不夠或者電泳時間不合適等，造成了目的條帶的表觀質量變大。

4.三個非特異性的分子量偏大條帶之一可能是目的蛋白在SDS PAGE出的問題出了問題，另外兩個帶可能本來就是雜帶了。可以回收后對三條帶用質譜檢測精確的分子量加以確定。

5.三個非特異性的分子量偏大條帶至少應該有雜帶，雜帶出現而且與一抗相互作用，那么只能說雜帶的順序表位也能被一抗識別，必須更換專一性更高的抗體。

6.還有考慮鎳柱親和分離的問題，是不是獲得了你的需要的目的蛋白質。