要獲得微生物純培養，必須避免雜菌污染，因此對所用器材及工作場所進行消毒與滅菌。對培養基而言，更是要進行嚴格的滅菌。對培養基一般采取高壓蒸汽滅菌，一般培養基用1.05kg/cm2，121.3℃條件下維持15-30min可達到滅菌目的。在高壓蒸汽滅菌過程中，長時間高溫會使某些不耐熱物質遭到破壞，如使糖類物質形成氨基糖、焦糖，因此含糖培養基常在0.56kg/ cm2，112.6℃15-30分鐘進行滅菌，某些對糖類要求較高的培養基，可先將糖進行過濾除菌或間歇滅菌，再與其他已滅菌的成分混合；長時間高溫還會引起磷酸鹽、碳酸鹽與某些陽離子(特別是鈣、鎂、鐵離子)結合形成難溶性復合物而產生沉淀，因此，在配制用于觀察和定量測定微生物生長狀況的合成培養基時，常需在培養基中加入少量螯合劑，避免培養基中產生沉淀，常用的螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)。還可以將含鈣、鎂、鐵等離子的成分與磷酸鹽、碳酸鹽分別進行滅菌，然后再混合，避免形成沉淀；高壓蒸汽滅菌后，培養基pH會發生改變(一般使pH降低)，可根據所培養微生物的要求，在培養基滅菌前后加以調整。
在配制培養基過程中，泡沫的存在對滅菌處理極不利，因為泡沫中的空氣形成隔熱層，使泡沫中微生物難以被殺死。因而有時需要在培養基中加入消泡沫劑以減少泡沫的產生，或適當提高滅菌溫度。
培養基的滅菌方法
1、高壓蒸汽滅菌：
高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養基、接種器械和蒸餾水的滅菌。培養基在愛制備過程中混入各種雜菌，分裝后應立即滅菌，至少應在24h內完成滅菌工作。滅菌時一般是在0.105MPa壓力下，溫度121℃時，滅菌15~30min即可。消毒時間不宜過長，也不能超過規定的壓力范圍，否則有機物質特別是維生素類物質就會在高溫下分解，失去營養作用，也會使培養基變質、變色，甚至難以凝固。將蒸餾水或自來水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無菌水。 滅菌后的培養基可放到培養室中預培養3d，若無污染現象，則證明滅菌是徹di的，可以使用。暫時不用的培養基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培養基應在1周內用完，其他培養基最多也不要超過1個月。
2、過濾滅菌：
一些植物生長調節劑及有機物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養基一起進行高溫滅菌，而要使用細菌過濾器濾去其中的雜菌。細菌過濾器與濾膜（孔徑0.45微米）使用之前要先進行高壓滅菌。過濾后的溶液要立即加入培養基中，若為液體培養基，可在培養基冷卻至30℃時加入；若為固體培養基，必須在培養基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。
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