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  • 上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

    PCR產(chǎn)物的兩種檢測方法介紹
    點(diǎn)擊次數(shù):492 更新時(shí)間:2023-05-30

    PCR產(chǎn)物的檢測方法:

    瓊脂糖凝膠電泳

    這是實(shí)驗(yàn)室最chang用的方法,簡便易行,只需少量DNA即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時(shí),由于泳動(dòng)速度不同而被分離,經(jīng)溴化乙錠(EB)染色,在紫外光照射下DNA分子發(fā)出熒光而判定其分子的大小。

    用于電泳檢測PCR產(chǎn)物的瓊脂糖濃度常為1%—2%,應(yīng)該使用純度高的電泳純級瓊脂糖,這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質(zhì)。

    (1)制膠

    瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過薄則加樣孔樣品會(huì)溢出來,過厚觀察時(shí)熒光穿透不強(qiáng)以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配制2%凝膠100ml,稱取瓊脂糖2g于三角瓶中,加入100ml 0.5×TBE液,微波爐加熱2-5min,使瓊脂糖wan全溶解(注意不要暴沸),置室溫等溫度下降至60℃時(shí),加入終濃度0.5μg/ml的EB液,充分混勻后倒板(注意排除氣體)。

    (2)加樣和電泳

    上樣時(shí)一般取PCR反應(yīng)液5~10μl,加入3μl溴酚蘭液,充分混勻,加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩(wěn)壓可調(diào)中壓電泳儀,電泳工作液為0.5×TBE液,接通電源,使樣品由負(fù)極向正極移動(dòng)。60-100V恒壓電泳約30-60分鐘。

    (3)檢測

    將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺(tái)上進(jìn)行檢測,DNA產(chǎn)物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復(fù)合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現(xiàn),并與擴(kuò)增時(shí)所設(shè)的陽性對照比較,判斷陽性或陰性結(jié)果。也可在電泳時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)分子量作對照,判斷其擴(kuò)增片段是否與設(shè)計(jì)的大小相一致。

    聚丙烯酰胺凝膠電泳

    聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣,但在引物純化、PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切限制性長度多態(tài)性分析時(shí)常用到。

    聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨DNA片段的有效范圍:

    (1)制膠

    在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片,放上制膠架,擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。

    制備適量合適濃度的凝膠,使之略多于膠板。

    不同濃度(%)聚丙酰胺凝膠的制法:

    在加入TEMED和10%過硫酸銨后,立即混勻,倒入放置45℃角的玻璃板內(nèi),wan全注滿(注意不要有氣泡),迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔頂并夾緊,待30-60分鐘膠聚合后,取下膠板,放入電泳槽中固定。

    (2)加樣和電泳

    上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液,溢過加樣孔,拔出梳子,排出加樣孔中的氣泡,將PCR產(chǎn)物或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)物2與1上樣緩沖液混勻,用微量注射器加入加樣孔底部,使樣品在孔底成一層,兩側(cè)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)分子量的DNA Marker。

    以2-10V/cm電壓電泳,電泳時(shí)間足夠長,使片斷足以分開,待指示劑走到適宜位置時(shí)關(guān)閉電源,將膠片取出。

    (3)銀染

    分開兩塊玻璃板,將凝膠片放入100ml銀染固定液中振蕩15min,雙蒸水洗3次,每次2min,然后將凝膠片轉(zhuǎn)入100ml 0.2%的AgNO3中于搖床上染色約10min,吸去AgNO3液,用雙蒸水洗3次,每次30s,加入100ml顯色液約7-10min,待DNA帶顯示清除時(shí),吸去顯色液,加入固定液Na2CO3,靜置2-3min,取出凝膠觀察。

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