多重qPCR探針的熒光基團(tuán)的基本要求
1. 避免熒光基團(tuán)相互干擾
多重qPCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計要求比單一反應(yīng)體系的要復(fù)雜的多。檢測不同指標(biāo)的探針必須攜帶不同光譜范圍的熒光基團(tuán)。下圖是幾種常用的熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜，很多熒光光譜相近的熒光基團(tuán)，它們雖然最大發(fā)射波長不同，但是在附近的波段內(nèi)還是會有相互重疊的，一定要避免熒光基團(tuán)發(fā)射光譜之間的相互干擾。
2. 根據(jù)熒光強(qiáng)度分配檢測指標(biāo)
不同熒光基團(tuán)的熒光強(qiáng)度是有高有低的，例如FAM就是一個熒光強(qiáng)度相對較高的基團(tuán)，我們偏向于將其安排給相對表達(dá)量比較低的目的基因，而熒光強(qiáng)度相對較低的基團(tuán)可以用于檢測表達(dá)量比較高的如看家基因等，這樣會達(dá)到擴(kuò)增曲線平臺期接近的目的，結(jié)果會比較美觀。
3. 按照熒光定量PCR儀來選擇熒光基團(tuán)
不同熒光定量PCR儀的激發(fā)光和發(fā)射光都是不相同的，因此需要根據(jù)對應(yīng)的儀器選擇適配的熒光基團(tuán)。目前廣泛通用的熒光基團(tuán)為FAM（FITC），因此，絕大多數(shù)多重qPCR策略shou選的一個通道為FAM。如果使用儀器不適配的熒光基團(tuán)，則在此之前必須對儀器針對這種熒光基團(tuán)進(jìn)行矯正。目前，主流的熒光定量PCR儀還是能夠支持較多通道的多重檢測的，小編根據(jù)IDT的數(shù)據(jù)進(jìn)行了整理，貢獻(xiàn)出下表供您選擇：
4. 搭配淬滅基團(tuán)的選擇
在選完探針的熒光基團(tuán)之后，根據(jù)熒光基團(tuán)的種類搭配淬滅基團(tuán)即可，多重qPCR并不要求淬滅基團(tuán)的不同，例如兩重qPCR分別選擇了FAM及VIC作為熒光基團(tuán)，淬滅基團(tuán)可以統(tǒng)一選擇BHQ-1。
多重qPCR還需要優(yōu)化引物探針序列的特異性，防止其相互產(chǎn)生干擾；確定最佳的引物-探針比值等等工作。正常情況極限不超過4重，超過4重的會比較困難。
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