免疫熒光試驗(yàn)定義
一種免疫標(biāo)記技術(shù)。用于檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體。即用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中的抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，借此對(duì)標(biāo)本中的抗原進(jìn)行鑒定或定位。
⑴基本原理
染色程序分為兩步，第一步，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。
⑵試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋。
搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
⑶實(shí)驗(yàn)步驟
1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。
2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過(guò)0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩。
4）取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。
5）將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
6）重復(fù)操作3。
7）取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。
8）熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。
⑷注意事項(xiàng)
1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ，會(huì)使熒光減弱。
2）每次試驗(yàn)時(shí) ，需設(shè)置以下三種對(duì)照：
① 陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物
② 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物
③ 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物
3. 已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤(rùn)，避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色 。
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