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  • 上海遠慕生物科技有限公司

    植物DNA提取實驗,小白必看!
    點擊次數:741 更新時間:2020-11-26

    實驗方法原理

    這是一種快速簡便提取植物總DNA的方法。先將新鮮的葉片在液氮中研磨,以機械力破碎細胞壁,然后加入十六烷*基溴化銨分離緩沖液,使細胞膜破裂。同時將核酸與植物多糖等雜質分開(十六烷*基溴化銨,簡稱CTAB,是一種陽離子去污劑),再經氯-仿-異戊醇抽提去除蛋白,即可得到適合于酶切的DNA。

    實驗材料 幼嫩的植物材料

    試劑、試劑盒 液氮 CTAB抽提緩沖液 NaAC Tris-HCl  EDTA 氯-仿 異戊醇 TE buffer

    儀器、耗材 瓷研缽 離心管 離心機

    一、實驗試劑及材料

    1.  材料:幼嫩的植物材料0.5g左右。

    2.  試劑:液氮,CTAB抽提緩沖液:2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基*基溴化銨),1%β-巰基乙醇 1.4mol/L Nacl,20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris-Hcl pH8.0,3M NaAC,50mM Tris-HCl pH8.0,20mM EDTA,氯-仿:異戊醇(24:1),異丙醇 ,70%乙醇,TE buffer。

    二、實驗方法

    1.  取0.5 g植物材料,雙蒸水洗凈,并用濾紙吸干。

    2.  植物材料剪成1 cm左右碎片,放入預冷的瓷研缽中。

    3.  加入液氮速冷,研磨成細粉(越細越好)。

    4.  在5 ml離心管中加入抽提緩沖液2.5 mll,60℃保溫1小時。

    5.  15 000 rpm,離心10分鐘。上清轉入另一個新的離心管中。

    6.  加入等體積氯-仿:異戊醇(24:1),混勻抽提至水乳膠融狀。

    7. 15 000 rpm,離心10分鐘。

    8.  上清轉入另一個新的離心管中。

    9.  加入2/3倍體積預冷異丙醇,-20℃保溫30 min-1 h,緩緩混勻DNA成絮狀折出。

    10.  15 000 rpm,離心10分鐘,棄上清。

    11.  DNA沉淀用 70%乙醇洗2次。

    12.  加入400 ul TE buffer溶解DNA。

    注意事項:真核細胞基因組較大,在操作中應注意動作輕柔,且在低溫下進行,以大限度地減少機械和化學作用對DNA的剪切,從而獲得相對完整的DNA。

    其他
    以下幾點可能會有所幫助: 1. 堅持使用2-巰基-乙醇和PVP; 2. 取幼嫩一點的材料; 3. 低溫; 4. 快速; 5. 酚氯-仿抽提離心后, 小心吸取上清液, 求質量而不求數量; 6. *的一點技巧, 酚氯-仿抽提時盡可能充分混勻。

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