DNA的不同提取方法及比較
傳統的DNA提取方法
傳統的DNA 提取與純化,如 CTAB 法、SDS 法是在裂解細胞的基礎上,多次苯/酚氯仿等有機溶劑抽提使蛋白質變性沉淀于有機相,而核酸保留在水相,達到分離核酸的目的;加入RNA 酶除去核酸中的RNA; 然后加入異丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除去分離過程中殘留的有機溶劑和鹽離子,以免影響核酸溶解和抑制后續步驟的酶促反應,最后用TE 溶解DNA 備用。 CTAB 是一種陽離子去污劑,能與核酸形成復合物,此復合物在高鹽( > 0. 7 mol/ L) 濃度下可溶,并穩定存在,但在低鹽濃度(0. 1～0. 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸復合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白質及多糖等仍溶解于溶液中。通過有機溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。經離心棄上清后,CTAB - 核酸復合物再用70 %酒精浸泡可洗脫掉CTAB 。SDS 是一種陰離子去垢劑,在高溫(55～65 ℃) 條件下能裂解細胞,使染色體離析、蛋白變性,同時SDS 與蛋白質和多糖結合成復合物,釋放出核酸;提高鹽(KAc 或NH4Ac) 濃度并降低溫度(冰浴) ,使 SDS - 蛋白質復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式,使蛋白質及多糖雜質沉淀更加*,離心后除去沉淀;上清液中的 DNA 用酚/ 氯仿抽提,反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS 法操作簡單,溫和,也可提取到高分子量的DNA ,但所得到的產物含糖類雜質較多。基因組DNA 經典的提取方法由于無需昂貴儀器和藥品,提取的DNA 純度能夠滿足一般分子生物學的需要,一直作為DNA 提取的常規方法。但這種方法操作步驟復雜,耗時長,易交叉污染,殘留在DNA 溶液中有機物質對DNA 聚合酶有抑制作用。另外,酚、lv仿等有機溶劑易造成環境污染,有損操作者健康,因此使該方法的應用受到一定的局限性。
DNA提取新方法
近年來出現了以螯合樹脂、特異性 DNA 吸附膜、離子交換純化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基礎 DNA 提取新方法。這些方法主要應用于提取病毒、微生物、人和動物細胞、包埋組織樣品、古生物標本及土壤環境樣品 DNA 。已有多篇利用純化柱和玻璃粉純化植物基因組 DNA 的報道。馬小軍等將CTAB 液提取和氯仿抽提兩步的上清液直接通過Wizard 純化系統純化得到的DNA ,RAPD 擴增效果良好,產率達2 250μg/ g 。張博等用硅珠(SiO2) 顆粒吸附DNA 純化方法,從不同樹木葉片中均得到了高質量的 DNA 樣品 。黃椰林等對常規CTAB 法提取的DNA 用玻璃粉懸浮液純化,所獲DN 的APCR 產物能直接測序,比較適用于富含黏多糖、單寧、多酚和萜類化合物等次生代謝物的植物樣品和長期保存的標本材料。袁長春等也用玻璃粉吸附法從富含酚類的茶類植物中提取純凈的總DNA。
目前國內外開發了多種商品化的DNA 提取純化試劑盒,其分離原理有的利用核酸的分子量差異,有的利用特異性膜與DNA 結合達到分離、回收的目的,如離子交換柱、磁珠等。這些試劑盒針對不同的材料來源設計了不同的提取方法,操作簡單、高效, DNA 質量較高,但價格昂貴,提取量少。著名的國外的試劑盒生產廠家有Sigma2Aldrich、Promega、Invitrogen、 TaKaRa 、Whatman 等,它們針對不同來源的材料如微生物、動物體液、血液和組織、植物、加工產品、轉基因產品等開發出一系列的試劑盒。
除此之外,由于核酸提取純化試劑盒制作門檻低,還有大量的生物公司提供試劑盒產品,使用者一定要慎重選擇。DNA 試劑盒經過了幾十年的發展,已經不再局限于單純的提取純化,有些廠家推出了DNA 提取—擴增 PCR 試劑盒,將DNA 提取和PCR 擴增結合起來,極大的提高了工作效率,如Sigma2Aldrich 公司的Sigma’s Extract2N2Amp Plant PCR kit 等。另外,還有高通量的DNA 提取產品,如高通量組織細胞研磨儀MM301 ,在常溫和冷凍條件下對硬性、中硬性、韌性、脆性及纖維材料的研磨破碎,每次處理樣品的個數可以多達48 個甚至192 個。美國應用生物系統公司6100 型核酸提取儀,可用于RNA、DNA 的提取純化,可自編程序, 可選預設的程序,具有嚴格的防交叉污染體系,可從不同來源的樣品中同時提取96 個樣品。
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