1. 凝膠的選擇
根據層析物質分子量的大小選擇不同型號的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G25或G50，G250多用于分離蛋白質單體，G200多用于分離蛋白質凝膠聚合體等。
2. 凝膠的預處理
稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時間應根據不同型號的凝膠而定。
凝膠量與型號和層析柱大小與規格及凝膠用量
層析柱規格 凝膠的規格和用量（g）
直徑（cm） 高（cm） 容量（ml） G25 G50 G100 G200
0.9 15 9.5 2.5 1 0.6 0.3
0.9 30 19 5 2 1.2 0.6
0.9 60 38 10 4 2.5 1.2
1.6 20 40 10 4 2.5 1.2
1.6 40 80 20 8 5.0 2.4
1.6 70 140 35 14 9.0 4.4
1.6 100 200 50 20 12.5 6
2.6 40 210 50 20 12 7
2.6 70 370 90 35 20 12
2.6 100 530 130 50 30 17
2.6 60 1000 250 110 70 35
為使粒子均勻一致需進行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉淀的粒子，如此反復數次即可。
3. 裝柱
層析柱的選擇一般根據分離樣品的種類和樣品的數量而定。純化蛋白質時，柱床體積應為樣品體積的25～100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4～10 倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內徑也要選擇適當。內徑過細，會發生“器壁效應"，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內徑和高度應有一定的比例。對于除鹽來說應為1:5～1:25；對于純化蛋白質來說應為1:20～1:100。
4. 加樣與洗脫
樣品體積不宜過多，最好為床體積的1％～5%，最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。
洗脫液應與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會發生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用 0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液（0.14Mol/L NaCl）。
5. 洗脫液收集
利用自動分步收集器收集，并以20%磺基水楊酸測試，當蛋白液下來時，開始分管收集，至無蛋白液為止。
6. 凝膠柱的重復使用與保存
當樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可加入新的樣品，繼續使用。保存方法有三種：
（1） 在液相中保存最/方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑（如0.002%洗必泰）或高壓滅菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
（2） 用完后，以水沖洗，然后用60%~70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態下保存。
（3） 長期不用者，最好以干燥狀態保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于 60℃~80℃干燥后保存。加乙醇時，切忌一上來就用濃乙醇處理，以防結塊。
