1、配制溶液
向容器內加入所需水量的一部分，按照培養基的配方，稱取各種原料，依次加入使其溶解，最后補足所需水分。對蛋白胨、肉膏等物質，需加熱溶解，加熱過程所蒸發的水分，應在全部原料溶解后加水補足。
配制固體培養基時，先將上述已配好的液體培養基煮沸，再將稱好的瓊脂加入，繼續加熱至完/全融化。并不斷攪拌，以免瓊脂糊底燒焦。
2、調節pH值
用pH試紙（或pH電位計、氫離子濃度比色計）測試培養基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH進行調節，直到調節到配方要求的pH值為止。
3、過濾
用濾紙、紗布或棉花趁熱將已配好的培養基過濾。用紗布過濾時，最好折疊成六層，用濾紙過濾時，可將濾紙折疊成瓦棱形，鋪在漏斗上過濾。
4、分裝
已過濾的培養基應進行分裝。如果要制作斜面培養基，須將培養基分裝于試管中。如果要制作平板培養基或液體、半固體培養基，則須將培養基分裝于錐形瓶內。
分裝時，一手捏松彈簧夾，使培養基流出，另一只手握住幾支試管或錐形瓶，依次接取培養基。分裝時，注意不要使培養基粘附管口或瓶口，以免浸濕棉塞引起雜菌污染。
裝入試管的培養基量，視試管和錐形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培養基時，每只15×150毫米的試管，約裝3～4毫升（1/4～1/3試管高度），如制作深層培養基，每只20×220毫米的試管約裝12～15毫升。每只錐形瓶裝入的培養基，一般以其容積的一半為宜。
5、加棉塞
分裝完畢后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是過濾空氣，避免污染。棉塞應采用普通新鮮、干燥的棉花制作，不要用脫脂棉，以免因脫脂棉吸水使棉塞無法使用。制作棉塞時，要根據棉塞大小將棉花鋪展成適當厚度，揪取手掌心大小一塊，鋪在左手拇指與食指圈成的圓孔中，用右手食指插入棉花中部，同時左手食指與拇指稍稍緊握，就會形成1個長棒形的棉塞。棉塞作成后，應迅速塞入管口或瓶口中，棉塞應緊貼內壁不留縫隙，以防空氣中微生物沿皺折侵入。棉塞不要過緊過松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落為合適。棉塞的2/3應在管內或瓶內，上端露出少許棉花便于拔取。塞好棉塞的試管和錐形瓶應蓋上厚紙用繩捆札，準備滅菌。
6、制作斜面培養基和平板培養基
培養基滅菌后，如制作斜面培養基和平板培養基，須趁培養基未凝固時進行。
(1)制作斜面培養基。在實驗臺上放1支長0.5～1米左右的木條，厚度為1厘米左右。將試管頭部枕在木條上，使管內培養基自然傾斜，凝固后即成斜面培養基。
(2)制作平板培養基。將剛剛滅過菌的盛有培養基的錐形瓶和培養皿放在實驗臺上，點燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下棉塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開培養皿蓋，右手迅速將培養基倒入培養皿中，每皿約倒入10毫升，以鋪滿皿底為度。鋪放培養基后放置15分鐘左右，待培養基凝固后，再5個培養皿一疊，倒置過來，平放在恒溫箱里，24小時后檢查，如培養基末長雜菌，即可用來培養微生物。
有一種簡捷快速制備斜面培養基的方法，現介紹如下：
制作培養基斜面，傳統的方法是將試管每10支為一組扎成一捆，高壓滅菌后，一支一支地擺成斜面，操作比較煩瑣，占用面積又多，造成諸多不便。
1、將膠合板截成長18厘米(與試管長度相等或略短)、寬9厘米(比并排5支試管直徑的總和略窄)的小塊備用。
2、在并排5支試管上面平置截好的膠合板，再在膠合板上面并排放5支試管，然后將試管的上、下端分別用牛皮紙包好，用線扎緊，使膠合板兩側的試管保持平行，置高壓鍋中滅菌。
3、高壓滅菌后，經自然冷卻，待氣壓降至零時，將高壓鍋的鍋蓋打開點，當棉塞水分充分蒸發后取出，不用拆捆，直接擺成斜面。大量制斜面時，既快捷又很少占用空間，非常方便，還便于保溫，減緩凝結速度，充分吸收游離水分。
4、如需將斜面培養基保存一段時間，可在滅菌前將聚丙烯塑料袋套在試管外并扎緊袋口，滅菌后取出，直接擺成斜面，可防止水分蒸發。
