一、實驗?zāi)康?/span>
1. 了解凝膠層析的原理及其應(yīng)用。
2. 通過測定蛋白質(zhì)分子量的訓(xùn)練，初步掌握凝膠層析技術(shù)。
二、實驗原理
凝膠層析又稱排阻層析，凝膠過濾，滲透層析或分子篩層析等。它廣泛地應(yīng)用于分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽、去熱源等，而測定蛋白質(zhì)的分子量也是它的重要應(yīng)用之一。凝膠是一種具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且呈多孔的不溶性珠狀顆粒物質(zhì)。用它來分離物質(zhì)，主要是根據(jù)多孔凝膠對不同半徑的蛋白質(zhì)分子（近于球形）具有不同的排阻效應(yīng)實現(xiàn)的。亦即它是根據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。對于某種型號的凝膠，一些大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而wan全被排阻在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由擴散，滲透進(jìn)入凝膠內(nèi)部的篩孔，爾后又被流出的洗脫液帶走。分子越小，進(jìn)入凝膠內(nèi)部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子與小分子之間，只能進(jìn)入一部分凝膠較大的孔隙，亦即部分排阻，因此這些分子從柱中流出的順序也介于大、小分子之間。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，分子便按照從大到小的順序依次流出，達(dá)到分離的目的。
對于任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱中被排阻的范圍均在0～100%之間，其被排阻的程度可以用有效分配系數(shù) Kav（分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示，Kav值的大小和凝膠柱床的總體積（Vt）、外水體積（V0）以及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)：
Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1)
在限定的層析條件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是隨著分離物分子量的變化而改變。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。
有效分配系數(shù)Kav是判斷分離效果的一個重要參數(shù)，同時也是測定蛋白質(zhì)分子量的一個依據(jù)。在相同層析條件下，被分離物質(zhì) Kav值差異越大，分離效果越好。反之，分離效果差或根本不能分開。在實際的實驗中，我們可以實測出Vt、V0及Ve的值，從而計算出Kav的大小。對于某一特定型號的凝膠，在一定的分子量范圍內(nèi)，Kav與logMw (Mw表示物質(zhì)的分子量) 成線性關(guān)系：
Kav ＝－b logMw + C --------- (2)
其中 b,C為常數(shù)。
同樣可以得到：
Ve ＝－b’logMw + C’ --------- (3)
其中 b’, C’為常數(shù)。即 Ve 與 logMw 也成線性關(guān)系。我們可以通過在一凝膠柱上分離多種已知分子量的蛋白質(zhì)后，并根據(jù)上述的線性關(guān)系繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后用同一凝膠柱測出其它未知蛋白的分子量。
三、器材與試劑
（一）器材
1. 玻璃層析柱（(20mm×60cm）
2. 恒流泵（或下口恒壓貯液瓶）
3. 自動部分收集器
4. 紫外分光光度計
5. 100ml試劑瓶
6. 1000ml量筒
7. 250ml燒杯
8. 50ml、 100ml燒杯
9. 10ml（或5ml）刻度試管
（二）試劑
1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白
（1）牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）
（2）雞卵清清蛋白：Mw=45,000（美國SIGMA公司）
（3）胰凝ru蛋白酶原 A：Mw=24,000（美國SIGMA公司）
（4）溶jun酶：Mw =14,300
2. 未知蛋白質(zhì)樣品：由實驗室準(zhǔn)備
3. 0.025M KCl－0.1M HAC(乙酸)（洗脫液1000ml）
四、實驗操作
（一）凝膠的溶脹
稱取7g Sephadex G- 75 于 250ml 燒杯中加入洗脫液100ml，置室溫溶脹2～3天，反復(fù)傾瀉去掉細(xì)顆粒，然后減壓抽氣去除凝膠孔隙中的空氣，沸水浴中煮沸2～3小時（可去除顆粒內(nèi)部的空氣及滅菌）。
（二）裝柱
1. 取潔凈的的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺上。
2. 凝膠柱總體積（Vt）的測定：
在距柱上端約 5cm 處作一記號，關(guān)閉柱出水口，加入去離子水，打開出水口，液面降至柱記號處即關(guān)閉出水口，然后用量筒接收柱中去離子水（水面降至層析柱玻璃篩板），讀出的體積即為柱床總體積Vt。也可以最后走完未知蛋白后再測定Vt。
3. 在柱中注入洗脫液（約1/3柱床高度），將凝膠濃漿液緩慢傾入柱中，待凝膠沉積約1cm ～ 2cm 高度后打開出水口，流速一般用 3ml～6ml / 10 min。膠面上升到柱記號處則裝柱完畢，注意裝柱過程中凝膠不能分層。然后關(guān)閉出水口，靜置片刻，等凝膠wan全沉降，則接上恒流泵，用1～2倍床體積的洗脫液平衡柱子，使柱床穩(wěn)定。
（三）V0的測定
吸去柱上端的洗脫液（切不要攪亂膠面，可復(fù)蓋一張濾紙或尼龍網(wǎng)）。打開出水口，使殘余液體降至與膠面相切（但不要干膠），關(guān)閉出水口。用細(xì)滴管吸取0.5 ml（2mg/ml）藍(lán)色葡聚糖— 2000，小心地繞柱壁一圈（距膠面2mm）緩慢加入,然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打開出水口（開始收集！），等溶液滲入膠床后，關(guān)閉出水口，用少許洗脫液加入柱中，滲入膠床后，柱上端再用洗脫液充滿后用3ml/10分鐘的的速度開始洗脫。最后作出洗脫曲線。收集并量出從加樣開始至洗脫液中藍(lán)色葡聚糖濃度最高點的洗脫液體積即為V0。注意：藍(lán)色葡聚糖洗下來之后，還要用洗脫液（1～2倍床體積）繼續(xù)平衡一段時間，以備下步實驗使用。
（四）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
1. 用洗脫液配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液全班共用，溶液中四種蛋白的濃度各為：牛血清清蛋白（2.5mg/ml）、雞卵清清蛋白（6.0mg/ml）、yi凝乳蛋白酶原A（2.5mg/ml）和溶jun酶（2.5mg/ml）。
2. 按（三）的操作方法加入上述標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（0.5ml～1 ml），以1.5ml/管/5分鐘的速度洗脫并收集洗脫液。
3. 用紫外分光光度計逐管測定 A280，并確定各種蛋白的洗脫峰最高點，然后量出各種蛋白的洗脫體積 Ve。由于每管只收集了1.5ml洗脫液，量比較少，因此比色時要加入一定量的洗脫液進(jìn)行測定。（一般的比色杯可以盛裝3ml溶液）。當(dāng)然，也可以用微量比色杯進(jìn)行測定。
4. 以 A280 為縱座標(biāo)，Ve 為橫座標(biāo)畫出標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫曲線。
5. 以 Kav 為縱座標(biāo)，logMw 為橫座標(biāo)作圖畫出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6. 以 Ve 為縱座標(biāo)，logMw 為橫座標(biāo)作圖畫出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
（五）未知蛋白分子量的測定
測定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的1.、2.、3. 步相同，然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得logMw,其反對數(shù)便是待測蛋白質(zhì)的分子量。
注意： 實驗完畢后，將凝膠全部回收處理，以備下次實驗使用，嚴(yán)禁將凝膠丟棄或倒入水池中。
