(一)堿裂解法提取質(zhì)粒
[實驗原理]
堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH值介于12.0~12.5這個狹窄的范圍內(nèi),線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互盤繞,仍會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)Ph至中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，在而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已wan全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
[實驗儀器與設(shè)備]
1.恒溫培養(yǎng)箱 2.恒溫?fù)u床
3.臺式離心機(最大轉(zhuǎn)速4000rpm) 4.冷凍高速離心機
5.高壓滅菌鍋 6.超凈工作臺
7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip
[實驗材料]
1.葡萄糖 2.三羥甲基氨基甲/烷(Tris)
3.乙2胺四乙酸(EDTA) 4.氫氧/化鈉
5.十二烷基硫酸鈉(SDS) 6.乙酸鉀
7.冰乙酸 8.氯/仿
9.乙醇 10.胰RNA酶
11.氨芐青mei素 12.蔗糖
13.溴酚藍(lán) 14.酚
15.β巰基乙醇 16.鹽酸
17.含pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌
附：試劑的配制
1.溶液Ⅰ
50mmol/L 葡萄糖
5mmol/L 三羥甲基氨基甲/烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)
10mmol/L 乙2胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
2.溶液Ⅱ
0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等體積混合
3.溶液Ⅲ
5mmol/L 乙酸鉀 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
水 28.5 ml
4.TE緩沖液
10mmol/L Tris·HCl
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
6.胰RNA酶
將RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫，保存于-20℃。
7.終止液:40%蔗糖、0.25%溴藍(lán)酚
8.酚
[實驗步驟]
(一) 提取質(zhì)粒
1.將2ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入到試管中，接入含質(zhì)粒的大腸桿菌，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
2.取1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，4000rpm，離心2min。
3.吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。
4.將細(xì)菌沉淀懸浮于100μl溶液Ⅰ中，充分混勻，室溫放置10 min。
5.加200μl溶液Ⅱ(新鮮配制)，混勻內(nèi)容物，將離心管放冰上5 min。
6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上預(yù)冷)，蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。
7.1200rpm，離心15 min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。
8.向上清中加入等體積酚：氯/仿(去蛋白)，反復(fù)混勻，12000rpm，離心5min,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中.
9.向上清加入2倍體積乙醇,混勻后,室溫放置5-10min。12000rpm離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。
10.用1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。
11.加50μl TE緩沖液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNAwan全溶解，-20℃保存。
(二)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA
[實驗原理]
瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp至50kb的DNA片段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠(ethidum bromide ,EB)，在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶，在電場中，pH8.0條件下，凝膠中帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移。
瓊脂糖凝膠有如下特點：
(1) DNA的分子大小 在凝膠基質(zhì)中其遷移速率與堿基對數(shù)目的常用對數(shù)值成反比，分子越大遷移得越慢。
(2) 瓊脂糖濃度 一個特定大小的線形DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率(u)的對數(shù)與凝膠濃度(t)成線性關(guān)系。
(3) 電壓 低電壓時，線狀DNA片段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過5v/cm。
(4) 電泳溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受電泳時的溫度影響不明顯，不同大小的DNA片段其相對遷移速率在4℃與30℃之間不發(fā)生明顯改變，但濃度低于0.5%的凝膠或低熔點凝膠較為脆弱，最好在4℃條件下電泳。
(5) 嵌入染料 熒光染料溴化乙錠用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料嵌入到堆積的堿基對間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀遷移率降低15%。
(6) 離子強度 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時會引起凝膠熔化。
對于天然的雙鏈，常用的幾種電泳緩沖液有TAE、TBE等，一般配制成濃縮母液，室溫保存，用時稀釋。
[實驗儀器與設(shè)備]
1. 恒溫培養(yǎng)箱
2. 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)
3. 高壓滅菌鍋
4. 紫外線透射儀
[實驗材料]
1.三羥甲基氨基甲/烷(Tris) 2.硼/酸
3.乙2胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚藍(lán)
5.蔗糖 6.瓊脂糖
7.溴化乙錠 8.DNA marker
9.DNA樣品
[實驗步驟]
1.緩沖液的配制
① 5×TBE(5倍體積的TBE貯存液)
配1000ml 5×TBE:
Tris 54g
硼/酸 27.5g
0.5mol/l EDTA 20ml
Ph8.0
② 凝膠加樣緩沖液(6×)
溴酚藍(lán) 0.25%
蔗糖 40%
③溴化乙錠溶液(EB) 0.5μg/ml
2.制備瓊脂糖凝膠
按照被分離DNA的大小,決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：
瓊脂糖凝膠濃度 線性DNA的有效分離范圍
0.3% 5-60 kb
0.6% 1-20 kb
0.7% 0.8-10 kb
0.9% 0.5-7 kb
1.2% 0.4-6 kb
1.5% 0.2-4 kb
2.0% 0.1-3 kb
3.膠板的制備
(1) 用高壓滅菌指示紙帶將洗靜、干燥的玻璃板的邊緣(或電泳裝置所皿備的塑料盤的開口)封住，形成一個膠膜(將膠膜放在工作臺的水平位置上，用水平儀校正)。
(2) 配制足夠用于灌滿電泳槽和制備凝膠所需的電泳緩沖液(1×TBE)。準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉。緩沖液不宜超過錐瓶或玻璃瓶的50%容量。 在電泳槽和凝膠中務(wù)必使用同一批次的電泳緩沖液，離子強度或pH值的微小差異會在凝膠中形成前沿，從而大大影響DNA片段的遷移率 。
(3) 在錐瓶的瓶頸上松松地包上一層厚紙。如用玻璃瓶，瓶蓋須擰松。在沸水浴或微波爐中將懸浮加熱至瓊脂糖溶解。注意：瓊脂糖溶液若在微波爐里加熱過長時間，溶液將過熱并暴沸。應(yīng)核對溶液的體積在煮沸過程中是否由于蒸發(fā)而減少，必要時用緩沖液補充。
(4) 使溶液冷卻至60℃。加入溴化乙錠(用水配制成10mg/ml的貯存液)到終濃度為0.5ug/ml，充分混勻。
(5) 用移液器吸取少量瓊脂糖溶液封固膠模邊緣，凝固后，在距離底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入瓊脂糖后可以形成完好的加樣孔。如果梳子距玻璃板太近，則拔出梳子時孔底將有破裂的危險，破裂后會使樣品從玻璃板之間滲透。
(6)將剩余的溫?zé)岘傊侨芤旱谷肽z模中。凝膠的厚度在3-5mm之間。檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。
(7)在凝膠wan全凝固后(于室溫放置30-45分鐘) ，小心移去梳子和高壓滅菌紙帶，將凝膠放入電泳槽中。
低熔點瓊脂糖凝膠及濃度低于0.5%的瓊脂糖凝膠應(yīng)冷卻至4℃，并在冷庫中電泳。
(8)加入恰好沒過膠面約1mm深的足量電泳緩沖液。
4.加樣
DNA樣品與所需加樣緩沖液混合后，用微量移液器，慢慢將混合物加至樣品槽中。此時凝膠已浸沒在緩沖液中。 一個加樣孔的最大加樣量依據(jù)DNA的數(shù)量及大小而定，一般為20-30μl樣品。
已知大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)同時加在凝膠的左凝膠的左側(cè)和右側(cè)孔內(nèi)。確定未知DNA的大小。測量未知DNA的大小時，要所有樣品都用相同的樣品緩沖液。
5.電泳
在低電壓條件下,線形DNA片段的遷移速度與電壓成比例關(guān)系,但是,在電場增加時,不同相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動度的增加是有差別的。因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨之減小。為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強度不應(yīng)高于5V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑移到到距離膠板下沿約1-2cm處，停止電泳。
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