流式細胞術(shù)：即FCM。很多小伙伴在做實驗過程中會碰到很多問題，比如：無信號、熒光強度高等一系列問題，接下來就來聊聊流式細胞技術(shù)！
目前，流式細胞術(shù)廣泛應(yīng)用于細胞表面和細胞內(nèi)分子表達特征的分析，界定不同種類的細胞群，測定分離出的亞類純度，分析細胞的大小和總量，它可以同時分析單個細胞的多個參數(shù)。它主要用于檢測標記在抗體上的熒光強度，這些熒光抗體則可以檢測與特定細胞分子結(jié)合的蛋白或配體，如與 DNA 結(jié)合的溴化丙啶 (PI) 等。
實驗原理
待測樣品(如細胞、染色體、精子或細菌等)經(jīng)熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過殼液包圍的進樣管而進入流動室，排成單列的細胞，由流動室的噴嘴噴出而成為細胞液流，并與入射激光束相交。細胞被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，由放在與入射的激光束和細胞液流成 90°處的光學(xué)系統(tǒng)收集之。光學(xué)系統(tǒng)中的阻斷濾片用于阻擋激發(fā)光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長。熒光檢測器為光電倍增管。散射光檢測器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細胞大小有關(guān)。
臨床應(yīng)用
1、 細胞生物學(xué)研究
流式細胞術(shù)可用于測定細胞周期各時相細胞的百分比。通過測定細胞群體中每個細胞的DNA含量，得出DNA含量分布曲線。同時可進行多參數(shù)分析，即同時測定一個細胞的多種性質(zhì)。如散射光和熒光，或多種不同顏色的熒光。此外,流式細胞術(shù)還可測定細胞群體同步化的程度和所處的時期，鑒別死細胞和活細胞，利用熒光標記配體，還可定量測定細胞表面和內(nèi)部的受體等。是研究DNA合成和細胞周期的一種非常有用的技術(shù)。
2、細胞免疫學(xué)
結(jié)合免疫熒光方法，流式細胞術(shù)可辨認和計數(shù)帶有不同表面特異性抗原的細胞，此外，流式細胞術(shù)還可用于定量分析結(jié)合于細胞上的熒光素標記的外源凝集素，測定細胞表面積和熒光素結(jié)合位點的相對密度，結(jié)合細胞動力學(xué)測定每個細胞結(jié)合位點的數(shù)目，以及研究各種外源凝集素與細胞表面結(jié)合的競爭性等。
3、腫瘤學(xué)
應(yīng)用主要是通過測DNA含量實現(xiàn)的，包括癌前病變檢查、早期癌變的檢出、化療指導(dǎo)以及預(yù)后評估等。
正常細胞均是DNA二倍體，當(dāng)細胞癌基因表達或者由良性的腫瘤細胞轉(zhuǎn)變成惡性腫瘤細胞時，這些細胞中DNA水平會發(fā)生改變，這些細胞的DNA倍體變化或者染色體結(jié)構(gòu)異常在FCM檢測過程中會以DNA倍體數(shù)量的改變表現(xiàn)出來。FCM對DNA異倍體精確的分析是腫瘤診斷、間葉組織良惡性腫瘤判斷的重要依據(jù)。利用FCM還可以測定腫瘤細胞的增殖活性、分化程度和凋亡水平，這些細胞參數(shù)與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，并為腫瘤臨床治療方案的選擇提供可靠的理論基礎(chǔ)。
4、遺傳學(xué)
用流式細胞術(shù)測定染色體DNA含量,可得到染色體頻率分布圖，稱為流式染色體核型分析。同類型染色體出現(xiàn)一個峰，峰的面積代表這種類型染色體的豐度。流式染色體核型分析技術(shù)不僅能快速分析核型，而且能分選出不同類型的染色體,做成人類每條染色體的DNA文庫，可用于人類基因組研究、遺傳病和癌癥的診斷的研究。
常見問題及解答
問題：無信號/熒光強度弱
問題分析：
1、 不正確的信號補償
2、 沒有足夠的抗體來檢測:增加抗體的量/濃度；
3、 無法接近細胞內(nèi)目標:檢查目標蛋白是否在細胞內(nèi)。
4、 細胞內(nèi)染色結(jié)合熒光分子太大
5、 激光器未對齊
6、 目標蛋白不存在或處于低水平表達
7、 可溶性或分泌型目標蛋白
8、 一抗和二抗不匹配
9、 熒光分子的熒光逐漸消退
解決方法
1、 確保所有的抗體都按照廠商的說明書正確存儲。
2、確保商品化抗體沒有超過有效期。
3、 確保已正確加入足量的抗體。
4、確保抗體已連接熒光素。如果未連接熒光素，需加入連接有熒光素的二抗。
5、使用了正確的二抗，就是說二抗能夠識別你的一抗。
6、檢測的是PE或APC熒光素的抗體，確保該抗體未被冰凍過。
7、檢測的組織上是否表達該抗原？可查看相關(guān)文獻了解該抗原的表達情況，或者同時做一個陽性對照。
問題：熒光強度過高
問題分析：
1、 抗體濃度過高
2、 過量抗體被困
3、 封閉不足
解決方法：
1、 減少每個樣本中加入的抗體量；
2、 確保洗滌步驟充分，包括在洗滌緩沖液中加入吐溫或 Triton；
3、 與封閉步驟一樣，抗體中加入1-3% 封閉試劑；
問題：觀察到兩個或多個細胞群但應(yīng)該只有一群細胞
問題分析：
1、 不止一類細胞表達目的蛋白
2、 出現(xiàn)細胞雙峰
3、 側(cè)向散射背景偏高（來自小顆粒）
4、 細胞裂解
5、 細菌污染
解決方法：
1、 確保細胞充分分離；
2、 染色前輕輕地混合細胞，在放入流式細胞儀前用吸管再次混勻，也可以篩選或過濾細胞以除去團塊
3、 樣品應(yīng)是新鮮的并且是正確制備的。細胞不能高轉(zhuǎn)速離心或劇烈震蕩；
問題：結(jié)果與預(yù)期相反
問題分析：
1、 有些試劑可能會影響某些抗原檢測，例如EDTA可影響一些血小板標記的檢測。
2、 裂解液也可以影響一些抗原檢測
3、 有些抗原是表達在胞內(nèi)的
解決方法：
1、 可采用PBMC提取法
2、 需選擇正確的破膜劑進行正確的破膜處理。
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